基于五首活血化瘀方治疗血瘀证家兔疗效差异探讨血瘀证“同证异方”

康健颖，李金霞，郑彩杏，赖丽娜，刘旺华，周小青

（湖南中医药大学，中医诊断学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208）

中医学强调证同而治同，证异则治异，理、法、方、药的有机统一是辨证论治的理论基础，从理论上讲，一个特定的证应对应唯一的治法，达到最佳治疗效果的方剂也只有一个［1］。但临床上存在“同证异方”现象，治疗某一病证的方剂常有多首，不同医生针对同一患者也可能开出不同的方剂，但都可获得一定的疗效［2-3］。“同证异方”现象的存在提示同病同证存在以多种方药治愈的可能，但同时也反映出中医诊断及处方的客观化、标准化、精细化仍有待完善。

血瘀证是动脉粥样硬化、冠心病等人类重大心血管疾病的主要证型，且常贯穿疾病始终［4］。活血化瘀是治疗血瘀证的基本治法，活血化瘀中药又有和血、活血、破血、逐瘀等作用程度之别，还有行气活血、益气活血、温经活血、活血止痛等小法，体现出功效的差异。但临床上活血化瘀方剂众多，医家多有混用，复杂的证治关系网不利于临床精准选方，也不利于中药复方的科学性解释与推广应用，因此有必要对这些方剂进行生物学定义，理清其作用机制及作用力差异，以提高血瘀证临床处方用药的针对性［5］。

课题组前期邀请方剂学专家论证，从活血化瘀经典方剂中选取单纯活血化瘀，佐助治法不明显的丹参饮、血府逐瘀汤、失笑散、活络效灵丹和桃红四物汤作为研究对象［6］，以网络药理学方法预测五首活血化瘀方治疗血瘀证的作用靶点，发现五首活血化瘀方拥有232 个共同的作用靶点，均可作用于“流体切应力与动脉粥样硬化”这一生物过程，由此从机制上证实了五首活血化瘀方共同治疗血瘀证的可能性机理；且五首方又分别有其特异性的作用靶点及通路，其治疗血瘀证的作用机制和而不同［7］，疗效差异仍需进一步明确。本研究应用饥饿+ 高脂+ 肾上腺素复合造模方法构建兔血瘀证模型，以五首活血化瘀方进行干预，观察干预后家兔血瘀体征、血常规、血脂、血液流变学、球结膜微循环及主动脉病理学变化，揭示五首活血化瘀方改善家兔血瘀状态的作用力差异，进一步阐释血瘀证“同证异方”内涵，同时为临床精准选方提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

同批次清洁级新西兰家兔70 只，雄性，体质量2.0～2.5 kg，购自湖南太平生物科技有限公司，合格证号：1107302011000864。饲养于湖南中医药大学实验动物中心，单笼饲养，室温（20 ± 5）℃，相对湿度（60±10）%，自由饮水，每隔12 h开灯照明。本实验过程经湖南中医药大学医学伦理委员会批准，伦理编号：LLBH－202006020001。

1.2 药品及试剂

组方［8］：丹参饮（丹参30 g，檀香6 g，砂仁6 g）；血府逐瘀汤（桃仁12 g，红花9 g，当归9 g，生地黄9 g，川芎5 g，赤芍6 g，牛膝9 g，柴胡3 g，桔梗5 g，枳壳6 g，甘草3 g）；失笑散（五灵脂6 g，蒲黄6 g）；活络效灵丹（当归15 g，丹参15 g，醋乳香15 g，醋没药15 g）；桃红四物汤（熟地黄12 g，当归15 g，白芍9 g，川芎6 g，桃仁9 g，红花6 g）。以上药物均购于湖南中医药大学第一附属医院，经湖南中医药大学药食同源食品工程中心进行质量控制检测。

高脂饲料（北京科澳协力饲料有限公司）；肾上腺素（上海陶素生化科技有限公司，批号：20190128）；总胆固醇测定试剂盒（南京建成生物科技有限公司，批号：A111－1）；甘油三酯测定试剂盒（南京建成生物科技有限公司，批号：A110－1）；高密度脂蛋白胆固醇试剂盒（南京建成生物科技有限公司，批号：A112－1）；低密度脂蛋白胆固醇试剂盒（南京建成生物科技有限公司，批号：A113－1）。

1.3 仪器

USB 显微放大镜（深圳inskam 公司）；SA－6600 型全自动血液流变测试仪（北京赛科希德科技股份有限公司）；MC－6200VET 型全自动血细胞分析仪（深圳MAXCOM 公司）；BA400 型显微镜（厦门麦克奥迪实业集团公司）；3K18离心机（美国Sigma公司）。

2 方法

2.1 药液制备

五首活血化瘀方按照上述剂量分别进行煎煮液制备，冷水浸泡30 min 后煎煮2 次，头煎煮沸时间为2 h，二煎为1 h，将2 次煎煮滤液混合浓缩后各方药液浓度分别为：丹参饮0.5 g/mL、血府逐瘀汤1 g/mL、失笑散0.25 g/mL、活络效灵丹1 g/mL、桃红四物汤1 g/mL，所得药液存放于4 ℃冰箱保存备用［9］。

2.2 模型建立

参照文献［10］和文献［11］方法，采用“饥饿+ 高脂+肾上腺素”方法制备家兔血瘀证模型。造模家兔适应性喂养1 周后，以90 g/d 剂量饲喂高脂饲料（60%正常进食量，10%蛋黄粉，5%猪油，1%胆固醇，0.2%丙基硫氧嘧啶），共40 d；实验第2 天开始隔日皮下注射肾上腺素0.1 mg/kg，共20 次。造模期间每7 d 称量1 次体质量，并根据体质量变化调整肾上腺素注射量。造模结束进行球结膜微循环、血液流变学和血脂检测，指标较正常组明显增高则为造模成功。

2.3 分组及给药

依据随机数字表将家兔随机分为正常组6 只和造模组64只，造模期间死亡7只，成模57只，造模成功后的家兔随机分为模型组、血府组、桃红组、丹参组、活络组和失笑组，每组9～10只。正常组及模型组给予同等剂量生理盐水灌胃，血府组、桃红组、丹参组、活络组和失笑组分别给予五首活血化瘀方连续灌胃治疗30 d。灌胃剂量根据人与家兔体表面积折算系数计算［12］，由于是五首方对比研究，因此各组均采用临床等效剂量。血府组：3.55 g/（kg·d）；桃红组：2.66 g/（kg·d）；丹参组：1.962 g/（kg·d）；活络组：2.80 g/（kg·d）；失笑组：0.56 g/（kg·d）。给药期间死亡13 只。

家兔剂量=成人剂量/70 kg×3.27

2.4 血瘀证体征积分计算

参照李净等［13］制定的《血瘀证体征量表》对家兔血瘀体征进行量化。①精神状态：精神委顿（3 分），倦怠嗜睡（5 分），对抗性、攻击性完全消失（7 分）；②毛发：毛发枯黄无润泽（3 分），毛发结穗打卷（5 分），毛发稀疏脱落（7 分）；③大便：轻度稀便（3 分），中度稀便（5 分），重度稀便或黄绿褐色黏臭便（7 分）［14］；④局部肿块：有肿块（5 分）；⑤唇周：暗红（3 分），紫暗（5 分）；⑥眼球：眼球由淡红转为深红（3 分），转为暗红（5 分）；⑦耳廓：暗红（3 分），紫暗（5 分）；⑧爪甲：爪甲尾部紫暗（3分），爪甲紫暗脱落（5分）。

2.5 球结膜微循环检测

将家兔在清醒的状态下置于兔固定盒内，把两耳及头部露出，以眼科开睑器将上下眼睑撑开，充分暴露出球结膜血管，排除结膜刺激的情况下，在USB显微放大镜下观察并记录家兔球结膜微血管，参考李国贤［15］提出的血瘀证目征积分方法，根据血管扭曲条数、增粗条数、血管瘤、网状畸形、新鲜出血、陈旧性出血、损伤点、血管色调，并结合眼周皮肤色调进行积分判断血瘀证及其轻重程度，具体赋值见表1［16］。

表1 血瘀证目征计分表

2.6 血脂检测

末次灌胃24 h 后，所有家兔以戊巴比妥钠按40 mg/kg 剂量耳缘静脉注射麻醉，腹主动脉取血，常温放置1 h 后于4 ℃下3 000 r/min 离心15 min 分离血清，按照试剂盒说明书进行总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）检测。

2.7 血液流变性及红细胞检测

腹主动脉血5 mL，采用枸橼酸钠抗凝，4 h 内血液流变仪测定全血黏度（切变率1、50、200 1/s）、红细胞聚集率及卡松黏度。腹主动脉血2 mL，采用EDTA 抗凝，2 h 内血细胞分析仪测定红细胞计数（RBC）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、血红蛋白（HGB）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）及平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）。

2.8 HE染色观察主动脉病理学变化

剥离胸主动脉，包埋切片后行常规HE 染色：60 ℃烘箱中烤片30 min；梯度酒精脱蜡、水化，滴加苏木素染液染色2 min；流水冲洗，滴加1%盐酸酒精分化3 s；流 水冲洗30 s，滴 加1% 伊红 染色液200 μL，染 色3 min；梯度酒精脱水、透明，中性树胶封片，晾干后于200×光镜下观察各样品病理变化。

2.9 统计学方法

所有数据均采用SPSS 19.0 进行统计处理，各组计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析法考查显著性，方差齐时组间两两比较采用LSD 检验，方差不齐则采用Tamhane's T2 检验。以P<0.05代表差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组家兔体质量及一般情况的比较

正常组家兔精神良好，食欲佳，毛色平整有光泽，大便柔软成型；造模期间出现精神倦怠嗜睡，毛发色黄无光泽，稀疏脱落，个别出现皮下肿块，甚至溃烂，进食减少，造模期间死亡7 只；给药期间由于家兔性情胆小易惊，脆弱敏感，灌胃对其刺激较大，精神状态未见明显改善，给药期间死亡13 只，总病死率28.57%。每周记录各组家兔体质量，模型组较正常组体质量增加，除丹参组外，其余各给药组体质量较模型组有所减轻，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 各组家兔体质量增长情况比较（±s，kg）

表2 各组家兔体质量增长情况比较（±s，kg）

组别正常组模型组血府组丹参组活络组失笑组桃红组n 6 9 7 6 7 8 7第1周2.32±0.17 2.52±0.19 2.56±0.17 2.69±0.16 2.51±0.13 2.49±0.11 2.48±0.08第2周2.55±0.16 2.66±0.23 2.68±0.17 2.84±0.17 2.64±0.19 2.61±0.17 2.57±0.11第3周2.78±0.12 2.75±0.25 2.78±0.19 2.75±0.26 2.72±0.20 2.60±0.17 2.61±0.17第4周2.85±0.13 2.80±0.20 2.70±0.22 2.96±0.17 2.76±0.23 2.69±0.20 2.74±0.11第5周2.89±0.14 2.91±0.20 2.84±0.33 3.09±0.13 2.83±0.21 2.87±0.15 2.72±0.35第6周2.96±0.22 2.96±0.22 2.88±0.34 3.11±0.15 2.73±0.27 2.86±0.12 2.73±0.26第7周2.95±0.21 3.04±0.24 2.89±0.32 3.11±0.23 2.77±0.21 2.86±0.12 2.76±0.27第8周2.85±0.14 3.03±0.27 3.00±0.39 3.18±0.17 2.72±0.14 2.89±0.20 2.86±0.22第9周2.78±0.11 2.96±0.28 2.96±0.39 3.20±0.17 2.66±0.20 2.90±0.22 2.90±0.30

3.2 各组家兔脏器大体观的比较

造模后家兔心肺出现明显的病理改变，胸腔积液、腹水形成，心包大量积液，心脏脂肪沉积，主动脉粥样斑块形成，肺部出血点或肺实变，肝脏充血。对出现病理改变的例数进行统计，可知模型组超过半数出现胸腔积液、腹水及心包积液，2 例发现肉眼可见的动脉斑块；各治疗组的病理改变例数较模型组有所减少，未见动脉斑块形成。见图1、表3。

表3 各组家兔脏器病理情况比较［例（%）］

图1 血瘀证家兔造模前后心肺大体情况

3.3 各组家兔血瘀体征积分的比较

体征表现是判断血瘀证形成与程度的核心，只有动物被诱导出与血瘀证相同的体表特征，如局部肿痛、眼结膜血管扩张充血、唇周发黑、耳廓唇周暗红、爪甲尾部紫暗、舌暗红等，才可以判定为血瘀证动物模型［17］。参考《血瘀证体征量表》对各组家兔血瘀体征进行定量分析，模型组精神、毛发、肿块、眼球、唇周、耳廓、爪甲积分均较正常组显著升高（P<0.01），大便无显著变化；与模型组相比，五首活血化瘀方均可不同程度降低各项血瘀体征积分，其中以改善肿块、眼球的病理表现为主，血府逐瘀汤效果最为显著（P<0.01）。对血瘀体征积分进行总计，与正常组相比，模型组的总积分显著升高（P< 0.01）；与模型组相比，血府组、丹参组、失笑组、桃红组总积分显著降低（P<0.01），四首方之间作用差异无统计学意义（P >0.05）。此外，血府组、活络组、桃红组出现不同程度的大便溏稀，大便积分升高，这可能与其中含有润肠的当归有关。见表4。

表4 各组家兔血瘀证体征积分比较（± s，分）

表4 各组家兔血瘀证体征积分比较（± s，分）

注：与正常组比较，2）P<0.01；与模型组比较，3）P<0.05，4）P<0.01。

组别正常组模型组血府组丹参组活络组失笑组桃红组n6 9 7 6 7 8 7精神0.00 4.78±0.672）4.14±1.07 4.67±1.51 4.71±1.38 4.25±1.49 4.71±0.76毛发0.00 5.89±1.452）4.14±1.573）5.67±1.03 5.00±2.00 4.00±1.073）5.29±1.80肿块0.00 2.78±2.642）0.00±0.004）0.83±2.043）0.71±1.893）0.00±0.004）0.00±0.004）眼球0.00 5.00±0.002）1.43±2.444）3.33±2.58 2.86±2.67 2.50±2.673）1.43±2.444）唇周0.00 4.11±1.052）2.43±1.814）3.17±1.83 3.86±1.07 3.50±0.93 3.86±1.07耳廓0.00 4.11±1.052）3.86±1.07 2.50±1.55 3.29±2.36 3.88±1.81 3.29±2.36爪甲0.00 2.67±1.002）1.71±1.60 1.00±1.553）2.43±1.81 1.50±1.60 0.86±1.463）大便0.00 0.00±0.00 0.71±1.89 0.00±0.00 1.86±2.673）0.00±0.00 1.29±1.60总分0.00 29.33±5.122）18.43±6.134）20.67±6.023）24.71±9.183）20.00±7.054）20.71±5.154）

3.4 各组家兔球结膜微循环的比较

正常组家兔球结膜血管充盈，形态均匀流畅，球结膜呈淡红色；造模后血管怒张，甚则呈瘤状，血管形态扭曲或呈波浪形，微小血管出现网状畸形，血管充盈不佳，球结膜呈淡紫色，甚者可见出血点。对目征进行赋值，与正常组相比，模型组血瘀目征积分显著升高（P<0.01）；与模型组相比，除血府组外，其余各组积分显著降低（P<0.05，P<0.01），各组间差异无统计学意义。见表5、图2。

图2 各组家兔球结膜微循环情况

表5 各组家兔血瘀目征总积分比较（± s，分）

表5 各组家兔血瘀目征总积分比较（± s，分）

注：与正常组比较，2）P < 0.01；与模型组比较，3）P < 0.05，4）P <0.01。

组别正常组模型组血府组丹参组活络组失笑组桃红组n6 9 7 6 7 8 7血瘀目征积分2.00±2.00 22.14±8.812）20.63±9.16 10.00±3.544）12.00±5.103）8.33±3.734）9.00±3.744）

3.5 各组家兔血脂的比较

兔对高脂饮食较为敏感，且血脂升高也是引起血液黏稠度增加的原因之一，对各组家兔血清进行血脂检测，与正常组相比，模型组的CHO、TG、LDL－C 均显著升高（P<0.01）；与模型组相比，失笑组的CHO、TG、LDL－C 水平均降低（P<0.05），表现出较好的降脂效果；血府组、丹参组亦表现出降低TG 的作用（P<0.05）。见表6。

表6 各组家兔血脂情况比较（± s）

表6 各组家兔血脂情况比较（± s）

注：与正常组比较，2）P<0.01；与模型组比较，3）P<0.05。

组别正常组模型组血府组丹参组活络组失笑组桃红组n 6 9 7 6 7 8 7 LDL-C（mmol/L）0.65±0.24 20.91±7.322）15.68±6.96 18.47±6.24 15.25±10.40 10.91±2.113）21.26±6.87 TG（mmol/L）0.77±0.22 8.99±5.542）4.79±1.463）5.60±2.063）8.97±2.06 5.49±1.073）6.68±3.24 CHO（mmol/L）4.83±0.97 65.92±9.572）50.52±11.92 60.71±17.71 53.88±18.31 48.29±10.913）52.86±16.49

3.6 各组家兔血液流变学的比较

与正常组相比，模型组全血黏度（切变率1、50、200 1/s）、红细胞聚集指数及卡松黏度均显著升高（P<0.01）；与模型组相比，五首活血化瘀方组的全血黏度（切变率1、50、200 1/s）和红细胞聚集指数均显著降低（P<0.01），其中在降低低切血黏度和红细胞聚集指数方面，失笑组疗效最好，与其余四组比较差异具有统计学意义（P<0.05），在降低中切与高切血黏度上，失笑组与丹参组疗效俱佳，优于血府组及活络组，桃红组最差，差异具有统计学意义（P<0.05）；在卡松黏度方面，除桃红组外，其余四组均可显著降低血瘀证家兔卡松黏度（P<0.01），四组间差异无统计学意义。见表7。

表7 各组家兔血液流变学情况比较（± s）

表7 各组家兔血液流变学情况比较（± s）

注：与正常组比较，1）P<0.05，2）P<0.01；与模型组比较，4）P<0.01；与失笑组比较，6）P<0.05，7）P<0.01；与桃红组比较，8）P<0.05。

?

3.7 各组家兔红细胞及血红蛋白的比较

与正常组相比，模型组红细胞计数显著下降，红细胞内血红蛋白含量及浓度代偿性升高，红细胞体积显著增大，但总的血红蛋白浓度仍较正常组显著减少，红细胞压积显著降低（P< 0.01）；与模型组相比，除失笑组和活络组外，其余三首活血化瘀方均可有效增加红细胞计数（P< 0.05，P< 0.01），其中桃红组的效果最佳（P< 0.01），但红细胞内血红蛋白含量及浓度较模型组降低（P< 0.05），总的血红蛋白含量未能得到改善（P>0.05）；在红细胞压积方面，仅有桃红组红细胞压积升高，差异具有统计学意义（P< 0.05）。见表8。

表8 各组家兔红细胞及血红蛋白情况比较（± s）

表8 各组家兔红细胞及血红蛋白情况比较（± s）

注：与正常组比较，1）P<0.05；与模型组比较，3）P<0.05，4）P<0.01。

?

3.8 各组家兔主动脉病理改变的比较

正常组主动脉结构正常，内膜、中膜、外膜结构清晰，内皮细胞完整，内弹力板光滑、连续、平滑，中膜中的弹性膜平行排列，层次清晰，平滑肌细胞及弹力纤维形态一致，排列规则。模型组血管结构紊乱，可见粥样斑块形成，内皮细胞脱落，纤维帽突出管腔，内有大量炎性细胞浸润，中膜大量胶原纤维及平滑肌增生，排列紊乱，中膜弹力膜大量缺失、断裂，外膜结缔组织增生。各治疗组壁结构较为清晰，见大量胶原纤维及平滑肌增生，厚薄不一，内皮细胞紊乱，炎性浸润较模型组显著减少，斑块突出程度较轻，弹力膜缺失断裂较少。见图3。

图3 各组家兔主动脉病理损伤情况（HE，×200）

4 讨论

血瘀证存在“同证异方”现象，针对临床血瘀证如何精准选方的问题，课题组选取常用的五首活血化瘀方剂——血府逐瘀汤、丹参饮、活络效灵丹、失笑散、桃红四物汤作为研究对象。五首方均可专注于发挥活血化瘀作用且佐助治法不明显，具有较好的可比性，且其活血化瘀作用又略有层次的不同。丹参饮以丹参为主药，配合檀香、砂仁行气，药性平和以和血［18］；活络效灵丹以丹参、当归为主，佐以乳香、没药，长于散瘀消肿止痛，为伤科要药［19］；失笑散使用蒲黄、五灵脂，长于化瘀止痛［20］；桃红四物汤在养血和血的四物汤基础上加桃仁、红花，破血逐瘀［21］；血府逐瘀汤又在桃红四物汤基础上合四逆散，破血的同时辅以行气，进一步增强活血化瘀之功［22］。

本实验采用“饥饿+ 高脂+ 肾上腺素”复合造模方法，饥饿构成气虚因素，减缓血液运行；高脂以增加血液黏稠度，促进斑块形成；肾上腺素可收缩血管，加重血液瘀阻。参考《实用血瘀证诊断标准》［23］，可见造模后家兔出现皮下肿块，耳廓唇周暗红，爪甲尾部紫暗等血瘀体征，血瘀体征积分显著升高（P<0.01）；球结膜微血管怒张、扭曲，血管充盈不佳，甚则出血，血瘀目征积分显著升高（P< 0.01）；心肺出现明显的病理改变，如胸腔积液、腹水、心包积液、主动脉粥样斑块形成等；同时血脂、血液流变学指标均显著升高，而红细胞计数及血红蛋白显著下降（P< 0.01），可知复合造模法成功复制了血瘀证家兔模型。实验期间总病死率为28.57%，与家兔胆小易惊、肠胃较为敏感有关，存活样本量仍可满足统计学要求。

应用五首活血化瘀方分别进行干预，在体征方面，血府组肿块、眼球、唇周积分显著降低（P< 0.01），疗效较好，丹参组、失笑组、桃红组次之，而活络效灵丹未表现出明显的疗效。血府组、活络组、桃红组出现不同程度的大便溏稀，这可能与其中含有润肠的当归有关。在改善球结膜微循环方面，除血府组外，其余四组积分显著降低（P<0.05）。各治疗组心肺大体病变及病理学损伤均减轻，未见动脉斑块形成。在调脂方面，失笑组的CHO、TG、LDL-C 水平均降低（P<0.05），表现出较好的降脂效果；血府组、丹参组TG 水平降低（P<0.05），桃红组及活络组未见明显改善。在改善血液流变方面，五首活血化瘀方的全血黏度和红细胞聚集指数均显著降低（P<0.01）；在作用力方面，失笑散>丹参饮>血府逐瘀汤、活络效灵丹>桃红四物汤。在红细胞检测方面，除失笑组和活络组外，其余三首活血化瘀方均可有效增加红细胞计数，桃红组疗效最佳（P<0.05）。

由此可知，五首活血化瘀方均可有效改善血瘀证家兔血瘀体征及球结膜微循环，调节血脂及血液流变，增加红细胞含量，减轻心肺及主动脉病理损伤，由此证实了多首活血化瘀方同时治疗血瘀证，即血瘀证“同证异方”的可能性机理，且五首方的作用环节又各有侧重，可为临床血瘀证的精准选方提供一定参考。血府逐瘀汤行气活血，可较好改善家兔全身血瘀体征，但对局部微循环的改善作用不显著，适于治疗全身及心胸部大血管的瘀阻；失笑散在调脂、改善血液流变方面表现最优，可用于高脂血症血瘀证的治疗；桃红四物汤长于养血、活血，而调脂、改善血液流变的作用较差，但在增加红细胞上疗效较好，充分体现了瘀血不去则新血不生的治法，与前人研究结果一致［24-25］；丹参饮在各方面的表现较为平均，与丹参药性较为平和有关；活络效灵丹则疗效较差，未能明显调脂及改善血瘀体征，但活络效灵丹长于定痛，通过动物实验无法测知。此外发现，应用血府逐瘀汤、活络效灵丹和桃红四物汤后家兔出现便溏，这可能与其中含有润肠的当归有关。