低温短日照诱导五叶草莓成花诱导的机理研究

向 淅，王思悦，蒲俊宏，唐雯璐，陈 清

(四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130)

五叶草莓()，蔷薇科、草莓属植物，是我国野生草莓种质的一种。具有抗寒、抗病性强、果实香味浓等特点，是进行栽种培育和改良的理想亲本，在我国西南和西北地区广泛分布。五叶草莓为二倍体，核型公式为2=2=14=12m+2sm，属1A类型，染色体数目少，基因组小，这些特点使其成为蔷薇科植物基因功能研究中具有良好应用潜力的材料。同时，其果实存在红色和白色两种不同类型，变异丰富。课题组前期发现，该材料叶盘再生能力极强，远远超过了广泛使用的森林草莓()，是进行遗传转化等操作的良好材料。但在实验室培养条件下花芽分化和成花条件并不明确，常规培养条件，即16 h光照/8 h黑夜，(23±2) ℃下不能完成花芽分化，进行开花结果等生理过程。

花芽分化是一个复杂的形态建成过程，可分为生理分化期和形态分化期两个阶段。通过对模式植物拟南芥和水稻等突变体的研究可知，成花诱导包含了光周期途径、春化途径、自主途径、年龄途径、赤霉素途径、常温途径以及最近发现的糖信号途径等多个不同的调控路径。植物对光照和温度两个关键环境因子及时且准确地响应并调控开花过程是其生存的前提，也是影响农作物生产的重要因素。光感受器如光敏色素(phytochrome，PHY)、隐花色素蛋白(cryptochromes，CRY)、UV-B受体蛋白UVR8等对成花的影响近年来得到了深入研究。生物钟组分如GIGANTEA(GI)蛋白，REVEILLE(RVE)蛋白，LUX ARRHYTHMO(LUX)蛋白等均参与了光信号调控开花的过程。这些因子传递的不同信号，通过时钟输出蛋白如CONSTANS(CO)进行输出，传递给成花整合蛋白FLOWERING LOCUS T(FT)和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)以及花器官一致性因子APETALA1(AP1)和LEAFY(LFY)，最终促进顶端分生组织完成花器官的诱导、分化以及发育过程。这些途径中大多基因具有保守性，而不同物种仍具有特异的调节基因。保守调控网络中，靠近下游的、、、1几个关键基因发挥着极其重要的作用。其中基因是光周期途径的输出基因，编码一个含CCT结构域的转录因子，能靶向基因的启动子。FT是成花信号多个途径的整合因子，有成花素之称，为PEBP磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族的成员，可以长距离转运。在长日照条件下，拟南芥叶片识别光信号，诱导基因的表达进而上调基因表达。紧接着，FT蛋白转移至茎尖分生组织，与转录因子FD蛋白相互作用，形成FT/FD蛋白复合物，激活下游基因1等的表达。参与了花分生组织的形成、分生组织正常功能的维持，以及防止花分生组织逆转的整个过程。在核小体中，LFY也可以通过与1启动子的特定顺式作用元件结合从而上调1来促进成花。和1是花分生组织形成过程的决定基因，标志着顶端分生组织由营养态向生殖态的转变。

生理分化完成后，叶原基的物质代谢及生长点组织形态开始发生变化，使花芽和叶芽得以区分，由此进入了花芽的形态分化期，并逐渐发育形成花萼、花瓣、雄蕊和心皮，直到开花前才完成整个花器的发育。整个过程仍然受到内在遗传因素的影响。Li等采用RNA-seq研究了二倍体森林草莓()的茎部分生组织，含茎尖分生组织(SAM)、花序分生组织(FM)和花托分生组织(REM)基因的差异表达情况，关键的转录因子如1、、和2等在共表达网络的一个模块中极显著富集。杨红发现，栽培草莓种苗质量、不同栽培模式，尤其是栽培过程中温度和日照时数是影响花芽分化的重要因子。

本试验以五叶草莓为材料，采用低温(15 ℃)短日照(8 h·d)条件进行成花诱导，分析了，，和1关键成花基因的表达情况，并对不同处理时间后茎尖分生组织形态进行了石蜡切片观察，确定了成花诱导时间，为利用五叶草莓进行分子生物学研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料与处理

野生五叶草莓植株采自四川省广元市，无菌培养参考王梅的方法。挑选长势一致、健壮的无菌组培苗50株，栽植于灭菌的泥炭土中，统一管理。待培养至旺盛生长阶段(1个月后)，于人工气候箱中进行短日照(8 h·d光照)和低温(15 ℃)处理。从处理开始，每隔7 d取一次样，每次取样3株。持续取样8周，8周后将剩余材料置于正常环境(白天25 ℃，夜晚20 ℃，16 h·d光照)下继续培养至开花。

1.2 成花基因生物信息学分析

从蔷薇科基因组数据库(GDR)下载二倍体森林草莓()的基因组序列信息(v4.02)。森林草莓转录组数据分析参考Li等，用于成花基因在茎部不同分生组织表达量的生物信息学分析。野生五叶草莓的基因序列源自课题组前期数据，NCBI登录号为SRP114679，用于成花基因在两种果实类型中不同发育阶段的表达量分析。以拟南芥，，和1序列为搜索序列，对森林草莓转录本进行BLASTN筛选(e-value=0.000 01)。利用TBtools软件绘制基因结构，分析其外显子、内含子和UTR区等在基因组序列上的数目、长度和分布情况。

1.3 成花基因的表达分析

RNA的提取采用改良CTAB法进行。参考Easy ScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒，进行cDNA第一链合成。采用SYBR Green法对、、1和在草莓花芽分化进程中的表达进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)相对定量分析。实时定量PCR的反应体积为20 μL，其中包含1 μL cDNA，10 μL 2×SYBR green Mix，浓度为10 mmol·L的正反向引物(表1)各1 μL。每个处理3个生物学重复和3次技术重复。扩增程序为95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s及72 ℃延伸10 s，共40个循环。反应使用CFX Connect荧光定量PCR仪，以2基因作为内参基因，不添加模板为阴性对照。相对表达量采用2-ΔΔC法计算。

表1 用于实时荧光定量的引物

1.4 草莓花芽分化进程的切片观察

采用常规石蜡切片法观测花芽的分化进程。2020年6月11日至8月6日，每隔7 d随机取样3株，切取茎尖生长点和侧芽生长点。4 ℃下用福尔马林-乙酸-乙醇混合液(FAA)固定，按照常规方法制备石蜡切片，切片的厚度25 μm，进行番红-固绿对染，中性树胶封片，Olympus BX51拍摄图像。

2 结果与分析

2.1 成花相关基因的筛选

因为五叶草莓缺乏参考基因组，因此以森林草莓基因组为参考进行目标基因的筛选。通过BLAST比对，共筛选出8个目标基因：CO仅筛选出一个同源基因4-213030；FT基因家族中筛选出了1(4-600090)、2(4-430710)和3(4-309870)3个成员；LFY基因家族中筛选出了1(4-303530)、2(4-304170)和3(4-509660)；AP1仅筛选出4-429600一个同源基因。

基因的结构如图1-A所示，基因最长，存在14个外显子和13个内含子。1基因的长度仅次于基因，含8个外显子和7个内含子。FT家族的3个基因中，UTR区、外显子、内含子数目一致，均由4个外显子和3个内含子组成，但由于内含子长度不一致，导致1、2、3长度有所差异。1基因跨基因组最长，第2个内含子明显长于其他2个基因，而2与3的差距则在于UTR区的长短差异。LFY基因家族中，1、2、3的UTR区、外显子和内含子数目也高度一致，分别由3个外显子和2个内含子组成。将FvFT与FvLFY各成员分别进行氨基酸序列比对，发现不同成员间的氨基酸序列高度一致。

2.2 成花基因在分生组织中的表达量

利用现有的转录组数据，对4种成花基因在森林草莓茎尖分生组织(SAM)、花分生组织(FM)和花托分生组织(REM)3种分生组织中的表达量进行了分析(图1-B)。1、2、2基因整体表达量低，3与1表达量较高且在各组之间表达情况相似。基因在FM中表达量相较于SAM和REM中低，而在SAM和REM中的表达量基本一致；3则是在FM中表达量最高，REM中最低；同样在FM中有较高表达量的还有3和1基因，但是它们在SAM中的表达均低于在REM的表达；而1则是在REM中表达量明显高于FM和SAM(在FM和SAM中表达量很低)。这些结果表明，同一基因不同拷贝之间可能存在功能分化，其中3和3在森林草莓中是主效基因。

A，成花基因结构分析；B，成花基因在茎部分生组织中的表达量；C，五叶草莓果实发育3个阶段中成花基因表达量热图。A， Analysis of the structure of flowering genes； B， The expression level of floral genes in the Fragaria vesca shoot meristematic tissues； C， Heat map of floral gene expression in three stages of Fragaria pentaphylla fruit development.图1 四种成花关键基因生物信息学分析Fig.1 Bioinformatics analysis of the four key genes for flowering initiation

2.3 成花基因在两种五叶草莓果实不同发育阶段中的表达量

利用课题组前期的转录组数据，我们对4种成花基因在五叶草莓两种果实类型不同发育阶段的表达量进行了分析(图1-C)。从结果可以看出，2、3、1、2、3表达量均较低，且在红白果实的不同发育阶段中表达量无明显差异。1在红白果实的不同发育阶段中的表达量相对较高，但低于1与的表达量。基因表达量相较于其他基因最高，但在果实的不同发育阶段中无明显差异，1基因随着果实的发育表达量呈降低趋势，且在白色五叶草莓果实中的表达量稍高于红色果实。1的基因表达水平在五叶草莓中表达量远远高于其他s的表达量，我们认为在五叶草莓中1为主效基因。

2.4 成花基因在五叶草莓叶片中的相对表达量

低温和短日照处理7 d后，我们检测了不同时间节点五叶草莓中4个关键成花基因的表达变化情况，结果如图2所示。在处理28 d 时，各基因处于极低表达水平(接近0，未展示)。基因于处理28 d 后进入表达高峰，随后表达量大幅下降，自35 d起呈现波动变化，表达量低。1基因自42 d起整体表达量较高，呈现下降趋势，但维持较高表达水平；1与3基因表达趋势相似，在42 d进入表达高峰，随后基因表达量降低，并维持在一定的水平。这一结果表明，处理28 d后，五叶草莓开始出现成花启动，在42 d时完成了由营养生长到生殖生长的转变过程。

2.5 花芽形态分化进程观测

花芽形态分化时顶端生长点由三角锥状逐渐肥大隆起，变得平坦宽阔，出现排列疏松的初生髓部，进而分化出花蕾原基，生长点变宽后分化为萼片原基，之后雄蕊、雌蕊原基相继分化出来。本研究中，五叶草莓经低温和短日照成花诱导后，花芽形态分化进程观测结果如图3所示。试验中组织切片结果观察到了未分化时期、花序分化期、萼片分化期及雌蕊分化期。花芽分化开始前，五叶草莓茎尖生长点呈平坦状态(图3-A)，随着处理的进行，生长点开始隆起、肥厚，呈圆顶状，侧芽开始分化，达到花序分化期(图3-B)。花序分化后，生长点形成了萼片(图3-C)、花瓣、雄蕊、雌蕊(图3-D)等花器官。

图2 短日照低温共同处理不同时间点四种成花基因在叶片中的相对表达量Fig.2 The relative expression levels of the four flowering genes in Fragaria pentaphylla after different time duration under the short-day and low-temperature treatment

A，未分化时期；B，花序分化期；C，顶花芽花萼分化期；D，雌蕊分化期。标尺：500 μm。A， Undifferentiated period； B， Inflorescence differentiation period； C， Apical flower bud calyx differentiation period； D， Pistil differentiation period. Scale bars： 500 μm.图3 五叶草莓的花芽分化进程Fig.3 Flower bud differentiation process of Fragaria pentaphylla

3 讨论与结论

植物开花会经历成花诱导、花的发育和花器官的成熟3个阶段，其中花的诱导是决定能否成花、何时成花以及花器官形态的关键时期。模式植物中所揭示的光周期途径、春化途径、自主途径、年龄途径和最新发现的糖信号途径往往并非单独发挥作用，而是相互关联，通过关键的成花整合因子进行汇聚后发挥作用。其中，光周期和温度是研究最多的两个因素。

在拟南芥几个关键的成花因子中，是光周期和低温信号的输出整合基因，可以把叶片感受的信号传递给下游的关键成花因子。本研究中，(4-213030)基因最先响应处理，于4周后出现表达高峰，随后表达量急剧降低，前期在一定程度上影响了1(4-600090)基因的表达，这一结果进一步反映了不同物种中成花诱导因子功能的保守性。其下游的因子还可以响应其他信号，通过长距离运输汇聚于茎尖分生组织。前期研究结果表明：短日照或低温刺激会诱导草莓基因表达从而促进开花，在本试验中进一步得到了验证。植物顶端分生组织在完成开花诱导后，开始进入花启动过程，涉及到的基因包括花分生组织特征基因、1、CAULIFLOWER()等。他们参与了早期的花器官分化以及维持的过程。1位于基因的下游，其表达受LFY的诱导。本研究中，1(4-429600)基因在处理过程中表达量相对稳定且持续，与3(4-509660)基因表达量趋势一致，且伴随1、3基因的表达观测到了花序分生组织继续分化形成了萼片及雌蕊，与此同时生物信息学分析显示花分生组织(FM)中3与1也表现出较高的表达量，有报道显示，1在之后2～3 d上调，说明3与1在促进花形成的过程中起着极其重要的作用，参与了花分生组织的形成。

虽然有日中性草莓栽培类型，但常见的栽培草莓多为短日照类型，当日照时间短于12 h时开始花的分化。而低温是栽培草莓完成花芽分化的必要条件。五叶草莓分布在我国的西偏北地区，其成花低温需冷量目前尚不清楚。本试验结果表明，通过相对低温(15 ℃)和短日照处理，五叶草莓可以在42 d内完成花芽诱导过程。这一结果为五叶草莓通过温光调控开花奠定了基础。