应用γ-干扰素释放试验在2型糖尿病患者中评价结核分枝杆菌潜伏感染的有效性

陈珣珣 赖晓宇 徐镠粤 魏 然

广东省结核病控制中心 广东广州 510630

Worken等[1]研究表明，大约16%的结核病患者会并发糖尿病，结核病死亡人数中有11%可归因于糖尿病，糖尿病已成为实现WHO 提出的2035年终止结核病流行战略目标的主要障碍之一[2]。由于糖尿病患者的固有免疫和获得性免疫功能均有不同程度受损，导致患者对结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)易感[3-4]，部分以潜伏性感染(latent tuberculosis infection，LTBI)的形式存在。当宿主细胞免疫功能低下时，LTBI随时有转化成活动性结核病的风险[5]，因此，在糖尿病患者中及早开展LTBI筛查，有助于提高诊断和治疗的及时性，减少结核病在医疗机构和社区中传播[6-7]，是控制结核病流行不可或缺的重要手段之一。

一直以来，由于结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)价格低廉，易于操作，在我国常用于大规模人群LTBI的主要筛查手段。然而近些年的研究发现TST对细胞免疫功能受损的患者检验效果欠佳。基于用 ELISA 检测人外周血中结核特异抗原刺激活化的效应T细胞分泌γ干扰素水平的γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays，IGRA)，成为目前诊断结核分枝杆菌感染的有效工具[8]，正成为大规模人群筛查LTBI的更优选择[9-10]。笔者对2019—2021年期间在广东省结核病控制中心门诊部就诊的550例患者进行回顾性分析，评价IGRA用于在糖尿病患者群体中开展LTBI筛查的价值，旨在为在结核病与糖尿病共病患者治疗管理等方面提供指导与参考。

1 对象与方法

1.1 病例选择

选取2019—2021年期间在广东省结核病控制中心门诊部就诊并行IGRA检查的550名患者作为研究对象。分组标准：参照《中国2型糖尿病防治指南(2020版)》有关标准[11]的要求。排除标准：①已患有活动性感染、恶性肿瘤、血液病、免疫变态反应性疾病患者；② 3个月前使用过其他免疫药物或者免疫抑制剂的患者；③同时患有其他躯体重大疾病。本研究已经中心伦理委员会批准。将纳入的 550 例患者分成Normal组和T2DM组，其中Normal组275例(男128例，女147例)，平均年龄(44±16.0)岁；T2DM组275例(男129例，女146例)，平均年龄(53±18.0)岁。

1.2 研究方法

1.2.1 IGRA检测 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒采用Quanti FERON-TB Gold(QFT测试，由加利福尼亚州凯杰公司生产)。采空腹血3 mL于肝素锂抗凝管，将其分装在对照培养管(N)、测试管(T)、阳性对照管(P)中，置于 37 ℃体外培养箱孵育16～24 h，取出后离心15 min收集血浆并于12 h内完成检测。按酶联免疫吸试验(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)试剂盒说明书进行定量检测。

1.2.2 TST检测 在采集IGRA检测用血的同时，对T2DM组进行TST 试验，对受试者进行皮内注射 PPD(5 U),注射部位为前臂屈测上1 /3 处，72 h后观察注射部位的反应情况。

1.3 判定标准

1.3.1 QFT 的结果判断标准 IFN-γ 数值(TB-Nil)≥0.35 IU/mL并且 ≥25% Nil(阴性对照)，结果判为阳性；如果阳性对照 TB-Nil ≥0.5 IU/mL，25% Nil>IFN-γ数值 (TB-Nil)≥0.35 IU/mL，或者 TB-Nil<0.35 IU/mL，结果判为阴性。其余情况结果判为不确定。

1.3.2 TST试验阳性结果 以硬结直径≥10 mm认定为TST试验阳性。

1.3.3 阳性预测值 Menzies等[12]根据患者的流行病学史、个人既往史和已知结核病易感因素等特征建立起来的计算模型，结合患者的IGRA结果，可计算出患者该次IGRA检验的阳性预测值(positive predictive value，PPV)，本文以≥95% PPV代表真正结核病感染的可能性，即确认为LTBI。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组IGRA阳性结果比较

两组IGRA阳性率分别是14.2%和13.8%，结合Menzies模型公式计算出两组LTBI分别43例与48例，两组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组IGRA阳性结果比较

2.2 两组IFN-γ含量比较

Normal组血浆中IFN-γ含量分布范围为-0.038～13.22 U/mL，T2DM组血浆中结核分枝杆菌特异性IFN-γ含量分布范围为 0.32 ～ 16.48 U/mL，两组不满足正态性分布(P<0.05)，故采用中位数(P138)作为受试者血浆中 IFN-γ的含量。T2DM组IFN-γ刺激释放值的中位水平为1.76 IU/mL，明显低于Normal组(2.19 IU/mL)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 IGRA 与 TST 试验在 T2DM组的诊断效能

在 T2DM组同时进行TST试验，阳性率为8.0%(22/275)，与IGRA检测阳性率为13.8%(38/275)比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 IGRA 与 TST 试验在T2DM组的结果分布

在T2DM组中随机抽取120名患者再一次进行结果比对。T2DM组的检测结果分为IGRA(+)/TST(+)6例、IGRA(+)/TST(-)12例、IGRA(-)/TST(+)3例和IGRA(-)/TST(-)99例，通过卡方检验发现，IGRA和TST两种方法对比在T2DM组有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 IGRA与TST试验在T2DM组的结果分析

3 讨论

γ-干扰素释放试验是利用感染者机体对结核分枝杆菌的持续性细胞免疫反应检测结核分枝杆菌感染的新方法，是近年来用于筛查和检查结核病的重要手段之一，尤其针对结核病高危人群的LTBI筛查与治疗可有效预防活动性结核的发生[13]。主要原理是机体感染病原菌后，会使机体产生记忆性T细胞，该细胞会对结核分枝杆菌特异性抗原产生刺激作用，导致其释放γ-干扰素。通过检测外周血中的γ-干扰素水平便间接反映了机体对结核分枝杆菌是否存在细胞免疫以及细胞免疫的强弱，从而间接判断机体内是否存在结核感染。根据中华医学会结核病学分会的《γ-干扰素释放试验在中国应用的建议》[14]，IGRA在筛查具有潜在免疫功能受损者的LTBI时仍具有一定价值。巫丽兰等[15]发现，在低蛋白血症患者中筛查潜伏性感染，应用IGRA的效果优于TST。

糖尿病患者因长期处于高血糖状态，其固有免疫系统和细胞免疫机制均存在一定程度的缺陷[16-17]。当糖尿病患者并发肺结核时，其临床症状可隐匿或轻微， 更可由于免疫预防机制的受损，出现疾病进展加快。另外，由于免疫机制受损，糖尿病患者合并结核感染时，临床和影像学特点也可表现多样化，给临床诊断带来困难，容易造成误诊和漏诊。因此，尽早甄选出免疫损害人群中的结核感染者，并对其进行有效的治疗或监测，在改善其生活质量以及结核病防控方面都有着重要的意义。

由于IGRA是通过评估患者机体对结核分枝杆菌的细胞免疫应答来完成的[18]，这也意味着糖尿病患者中的是否可能因糖尿病继发的细胞免疫受损而较难评估，在糖尿病患者中应用IGRA开展LTBI诊断评估是否有效，一直是结核病辅助诊断临床实践中需要反复验证的问题。本次研究发现，IGRA在两组的阳性率表现差异无意义。观察两组IFN-γ含量，T2DM组IFN-γ 含量中位水平为1.76 IU/mL，也低于Normal组患者(2.19 IU/mL)，这可能是因为在免疫受损患者中，反应机体免疫功能及应激程度的淋巴细胞计数会有所减少[19]，而IGRA结果又受外周血淋巴细胞计数的影响[20]，因此T2DM组患者 IFN-γ 含量低于Normal组。但IGRA阳性率保持与T2DM组基本一致，可能是免疫反应的强度并不是影响IGRA阳性率的主要因素。与IGRA结果相比，T2DM组TST阳性率率明显低于IGRA，这也进一步说明，TST 受机体免疫功能影响较大，而IGRA在免疫功能受损的患者中由于受免疫状态的影响相对较小，可获得更高的检测灵敏度，且在一定程度上避免了 TST 因机体免疫功能受损而产生的假阴性结果。但卢彩霞[21]曾表明，检测各项内分泌指标在糖尿病患者和健康对照组的变化，有较大差异，内分泌紊乱的情况下，患者免疫功能会明显减弱，加重患者病情，干扰IGRA和TST的检测结果。在T2DM组中，IGRA(+)/TST(-)、IGRA(-)/TST(+)分别有18和9例，针对TST与IGRA不一致的检测结果，有研究表明[22]，发现两种检测方法不一致结果均易发生于吸烟人群，一种潜在的致病机制是由于吸烟抑制了巨噬细胞的生物活性，降低了细胞免疫功能，并且在糖尿病患者体内，这种免疫紊乱更加明显。而结核分枝杆菌感染检测的不同方法均基于机体免疫反应，吸烟导致的免疫功能降低或抑制可能使检测结果不稳定。因此可以认为，IGRA不仅在免疫功能受损的肺结核患者诊断与鉴别诊断中具有优势[23-25]，在应用于合并免疫功能受损患者的结核潜伏性感染筛查中同样具有肯定作用。

IGRA是临床诊断、鉴别诊断结核病的重要辅助手段，但并不是确诊和排除结核病的“金标准”。 尽管IGRA在糖尿病组患者中表现出较高的特异性和灵敏度，但由于临床上存在临界性结果或“不确定”性结果。尤其是在应用于判断肺部活动病灶是否再次出现活动病灶等复治患者，TST和IGRA的价值仍存在质疑[26]。因此，任何情况下均不能单纯以IGRA阳性结果作为诊断的依据，而是将其作为辅助参考指标，同时结合患者流行病学史、年龄、患病史、医疗质量甚至检测质量等外部因素等综合考虑。本文的PPV是在两组初筛阳性的基础上采用了Menzies模型进行分析。Menzies模型是充分结合了IGRA结果的真阳性和假阳性、进展为活动性疾病的风险、年龄以及等其他结核病暴露的危险因素综合计算出来的，以≥95% PPV代表真正结核病感染的可能性，相比较以往单纯IGRA阳性结果，更具科学性、准确性和全面性，这种网络算法，在国外使用已久，也是我们现在可以参考并进一步验证的筛选方法之一。

本研究的局限之处在于，并未根据血糖控制情况和并发症情况进行细化分类。下一步研究计划开展针对不同阶段2型糖尿病患者行IGRA检测的研究，同时将市面上的其他IGRA检测试剂一并纳入研究范围进行横向对比，糖尿病与LTBI检测之间的关系亦更加全面和具有指导意义。