云南省两栖类新属纪录—越南姬蛙属

吴东益 刘小龙 刘春雨 史兴惠 杨泽鹏 施德山 袁智勇

（1. 西南林业大学云南省高校极小种群野生动物保育重点实验室，云南 昆明 650233；2. 云南大围山国家级自然保护区管护局屏边管护分局，云南 红河 661199；3. 云南省屏边县林业和草原局，云南 屏边 661200）

姬蛙科（Microhylidae）[1]隶属于两栖纲（Amphibia）无尾目（Anura），现存63属694种，主要分布于美洲、亚洲、澳大利亚北部、马达加斯加和撒哈拉以南的非洲地区[2]。中国共有姬蛙科物种5属，即小狭口蛙属（Glyphoglossus）[3]、细狭口蛙属（Kalophrynus）[4]、狭口蛙属（Kaloula）[5]、姬蛙属（Microhyla）[4]、小姬蛙属（Micryletta）[6]，共19个物种。

Nikolay等[7]根据姬蛙科Vietnamophryne inexpectata的标本建立新属Vietnamophryne，共3个物种，即V.inexpectata、V.orlovi、和V.occidentalis。Vietnamophryne inexpectata和V.orlovi的模式产地分别位于越南中部及北部的嘉莱省（Gia Lai Province）和高平省（Cao Bang Province），Vietnamophryne occidentalis模式产地位于泰国北部地区的清莱省（Chaing Rai Province），这3个物种目前都仅收集到1号标本。

2019年7 月，在对云南省大围山国家级自然保护区的调查中，采集到1号姬蛙科物种标本，经外部形态特征对比以及分子系统发育关系分析，鉴定为V. orlovi，为中国两栖动物分布的新属记录。对该物种采集地的生境进行了描述，为该属物种的进一步深入研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 标本采集与形态测量

2019年7月17日19：00，在屏边苗族自治县大围山国家级自然保护区（22°57′48.15″ N，103°41′58.31″ E，海拔1502 m）采集到1号标本（SWFU 036798），通过解剖查看性腺确定标本为雄性。股骨肌肉保存于95%乙醇溶液后，其余标本保存于75%乙醇溶液中，存放于西南林业大学生物多样性保护学院。根据Nikolay等[7]的测量方法，使用精确度为0.1 mm的游标卡尺对所采集到的标本进行了相应形态指标测量：头体长（SVL）、头长（HL）、吻长（SL）、眼径（EL）、鼻眼距（NEL）、头宽（HW）、鼻间距（IND）、眼间距（IOD）、上眼睑宽（UEW）、前肢长（FLL）、小臂及手长（LAL）、手掌长（HAL）、后肢长（HLL）、胫骨长（TL）、跗足长（FTL）、鼓膜径（TD）、鼓膜至眼距（TED）、指长（FL）及趾长（TOEL）。同时基于Nikolay等[7]对V.orlovi、V. occidentalis的形态描述与本例标本进行了形态比较。

1.2 分子实验与系统发育关系分析

使用ThermoFisher Scientific公司的DNA提取试剂盒对新采集标本的肌肉组织进行全基因组DNA的提取，使用聚合酶链式反应（PCR）对其16S rRNA基因片段进行扩增，引物为L3975（5′−CGCCTGTTTACCAAAAACAT−3′）和H4551（5′−CCGGTCTGAACTCAGATCACGT−3′）[8]。其反应程序为：95 ℃ 预热5 min，95 ℃ 变性1 min，退火温度为45 ℃，反应1 min，72 ℃ 延伸1 min，进行35个循环，最后72 ℃ 延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，最后由北京擎科生物科技有限公司对扩增产物进行双向测序。使用LASERGENE 7.0软件包[9]中的Seq-Man对所得序列进行质量检测和人工校对，生成一致序列。分别使用最大似然法（ML）和贝叶斯分析法（BI）重建Vietnamophryne的系统发育关系。根据Nikolay等[7]的研究结果，选取Gastrophrynoides immaculatus[10]、Siamophryne troglodytes[11]作为外群，共包括6条序列（表1），其中5条从GenBank数据库中下载。使用MEGA 6.0对每个16S rRNA序列进行比对和编辑[12]。使用jModelTest 2中的AIC标准推断序列最佳进化模型[13]，最佳模型为GTR + G。基于该模型，使用RAxML 8.2.4[14]构建最大似然树，自展1000次估算节点支持率。使用Mrbayes 3.1.2[15]进行贝叶斯法分析。设置贝叶斯核苷酸的替换模型为GTR +G模型，位点间变异速率分布为gamma，在默认热值下使用马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）链执行独立运算4次，每1000代抽样1次，执行3000万代，抛弃前25%，在运行中通过查看分散频率平均标准偏差 < 0.01来确定贝叶斯取样是否达到稳定。然后使用来自Mrbayes的分裂频率平均标准差（ASDSF）和潜在尺度缩减因子（PSRF）统计数据来评估拓扑收敛性和分支长度收敛性，最后通过使用Tracer v 1.5[16]来检测有效样本量（ESS > 200）来检查各运行参数值是否收敛。使用软件MEGA 5.0[12]中的Kimura双参数模型计算本研究新采集的标本与Vietnamophryne中已知物种的遗传距离。

表1 样品信息表Table 1 Sample information

2 结果与分析

2.1 标本形态描述

所采标本各部位度量数据见表2。标本为成年雄性，体型较小（头体长：16.8 mm）且肥硕（前臂及手长/头体长58.9%，后肢长/头体长为163%），吻部略凸，吻长（2.4 mm）略大于眼径（2.1 mm），鼓膜相对较小（1.1 mm），占头体长的6.5%。眼背部略凸，有颞褶，无犁骨齿，舌后端游离，无缺刻。无蹼，无缘膜，前肢短小（前臂及手长9.8 mm），第1指发育良好，长度小于第2指长度的1/2。无指基下瘤，无婚垫。指末端无凹槽，指尖不膨大，第3趾和第4趾趾尖微扩展，指序为I < II < IV < III，趾和指的关节下瘤均不明显，后肢长度（27.1 mm）为前肢长度（9.8 mm）的3倍，趾序为I < II < V < III < IV。背部整体呈砖红色，背中线清晰，有黑色暗纹、红色斑点和白色疣粒散布在背部和后肢背部。腹部皮肤光滑，整体呈柠檬黄，有棕色暗纹。头部呈棕红色，无疣粒与暗纹。吻部至颞部为黑褐色，掺杂有少量白色斑块。有一条白色细纹自吻部贯穿至上眼睑后缘（图1）。

表2 大围山国家级自然保护区所采姬蛙科物种标本（SWFU 036798）形态量度Table 2 Morphological measurement of Microhylidae specimens collected in Dawei Mountain National Nature Reserve (SWFU 036798)

图1 奥氏越南姬蛙标本（屏边苗族自治县大围山国家级自然保护区，SWFU 036798，雄性）Fig. 1 V. orlovi in preservation (Dawei Mountain National Nature Reserve, SWFU 036798, male)

2.2 生境描述

本次采集到的标本位于大围山国家级自然保护区的针阔混交林，属于湿润型的亚热带气候。采集地的步道两旁多有蕨类植物，落叶堆积，灌丛茂密。距采集点约15 m处有1个水库，距采集点约50 m处有一条溪流。在采集点附近还采集到大绿臭蛙（Odorrana graminea, Boulenger 1899）和黑眶蟾蜍（Duttaphrynus melanostictus, Schneider 1799）。

2.3 分子实验与系统发育关系

本研究新获得一条长度为571 bp的16S rRNA序列（Genbank序列号：OK377338），结合从GenBank下载的5条16S rRNA数据，共30个简约信息位点，87个碱基变异位点。使用BI和ML法构建系统发育树结果具有相似的拓扑结构，这里只展示贝叶斯系统发育树（图2）。本研究所采姬蛙科标本与V.orlovi模式产地（越南东北部地区的高平省）标本聚在一个支系内。使用Kimura双参数模型计算的遗传距离分析结果显示，新采集的姬蛙科物种标本与V.orlovi遗传距离较小，仅0.9%，与同属V.occidentalis、V.inexpectata2个物种的遗传距离分别为1.1%和3.9%。

图2 基于16S rRNA基因所构建的Vietnamophryne贝叶斯树。Fig. 2 Bayesian phylogenetic tree of the genus Vietnamophryne inferred from a fragment of 16SrRNA gene

2.4 讨论

本研究新发现的姬蛙科标本形态学鉴定特征符合V. orlovi的鉴定特征。首先该标本体型较小（头体长：16.8 mm），腹部皮肤光滑，整体呈柠檬黄，背部皮肤整体呈砖红色，有微微凸起的微小白色疣粒散布于背部、侧腹和后肢背部。其次，该标本鼻眼距（1.7 mm）占眼径（2.1 mm）的80.9%，吻长（2.4 mm）略大于眼径（2.1 mm）（114.2%）。新采集标本与模式标本异同点在于：本研究的标本体型略大，其头体长为16.8 mm，模式标本头体长为15.4 mm。本研究的标本头长略小于头宽（头长6.2 mm/头宽6.9 mm），模式标本头长略大于头宽（6.7 mm/5.8 mm），但差异不是非常明显，见表2。分子数据分析的结果也支持新采集到的标本为V. orlovi。其结果显示本文所采姬蛙科样本与V.orlovi聚在一起构成单系，两者的遗传距离仅为0.9%。综合外部形态特征与系统发育分析结果，确定新采集的姬蛙科物种标本为V.orlovi。根据Nikolay等[7]的研究将该属的中文名定为“越南姬蛙属”，V. orlovi的中文名定为“奥氏越南姬蛙”。

本研究结果揭示V.occidentalis可能是V.orlovi的次定同物异名。首先，本研究的标本与模式产地的V.orlovi和V.occidentalis之间的遗传分化均较小，其遗传距离分别为0.9%和1.1%，无明显差异。其次，V.orlovi和V.occidentalis之间的外部形态鉴别特征不稳定，且性状变异具有连续性（表3）：1）V.orlovi和V.occidentalis模式标本的头体长分别为15.4 mm和20.5 mm，本研究V.orlovi标本头体长为16.6 mm，仅靠一个标本很难判断头体长的变异是否连续；2）V.orlovi模式标本头长大于头宽（86.5%），V.occidentalis模式标本头长与头宽近似相等（99%），本研究V.orlovi标本头长小于头宽（111.3%）；3）V.orlovi和V.occidentalis模式标本的眼径与吻长比分别为141.3%和85.5%，本研究V.orlovi标本的眼径与吻长比为114.3%；4）V.orlovi模式标本鼻眼距与眼径的比值为109.5%，V.occidentalis模式标本鼻眼距与眼径的比值为55.2%，本研究V.orlovi标本鼻眼距与眼径的比值为85.7%；5）V.orlovi模式标本前肢与头体长的比值为53.3%，V.occidentalis模式标本前肢长与头体长的比值为62.7%，本研究V.orlovi标本前肢长与头体长的比值为58.9%。V.occidentalis模式标本与V.orlovi模式标本较为稳定的区别仅在于腹部颜色和指序，V.orlovi腹部颜色为柠檬黄，指序为I < IV < II < III，V.occidentalis腹部颜色为橘黄色，指序为I < IV < II < III；但颜色的根据仅基于一个标本的特征，不能排除颜色在个体间具有变异。基于以上特征，难以在形态上区别V.occidentalis和V.orlovi，这提示V.occidentalis可能是V.orlovi的次定同物异名。

表3 Vietnamophryne orlovi和Vietnamophryne occidentalis形态特征比较Table 3 Comparison of morphological characteristics of V. orlovi and V. occidentalis

3 结论

本次发现为我国的姬蛙科增加一个新属记录和一个物种新记录。本次采集点的环境是针阔混交林，Nikolay等[7]描述的生境为常绿阔叶林，说明本物种至少分布于这2种环境。此外，之前Nikolay等[7]的采集点海拔为1050 m和1200 m，本次的采集点海拔为1502 m，说明V. orlovi的分布范围至少在1050～1500 m。项目组成员在2019年7月采到一例标本后，在2019年8月14日至8月21日、9月28日至10月7日先后2次前往采集地点，均未能再次采集到更多个体。推测其原因，可能是7月之后，过了本物种的繁殖季节，或是因为其隐蔽的生活史，Nikolay等[7]提及本属物种大多为营半穴居生活，所以未能采集到更多个体。

致谢：感谢西南林业大学钱昱含老师对标本采集提供的帮助，感谢西南林业大学黄佳玥同学在分子鉴定方面给予的帮助，感谢屏边苗族自治县大围山国家级自然保护区的工作人员对野外工作给予的帮助。本研究得到了云南省基础研究计划（专项）优秀青年项目两栖动物多样性与演化研究（202001AW070016）、中青年学术和技术带头人后备人才项目（202005AC160046）、中国科协青年人才托举工程（2019−2021QNRC001）、生态环境部生物多样性调查、观测和评估项目（2019−2023年）的资助。