兔出血症病毒2型SC株VP60基因工程疫苗研制及其与传统兔出血症病毒疫苗的交叉保护作用

宋艳华， 胡 波， 范志宇， 魏后军， 陈萌萌， 仇汝龙， 徐为中， 王 芳

(江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程重点实验室，江苏南京 210014)

兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)属于杯状病毒科兔病毒属。该病毒引起的兔出血症以高感染率和死亡率为特征，严重阻碍养兔业发展，并对公共卫生安全存在潜在威胁。RHDV分为经典毒株GI.1(RHDV1)和变异毒株GI.2(RHDV2)2种基因型，GI.1又分为GI.1a、GI.1b、GI.1c和GI.1d等4种亚型。2010年 GI.2 首先在法国暴发，随后在欧洲、非洲、澳大利亚和美洲流行，且RHDV2有逐渐替代经典RHDV毒株成为主要流行毒株的趋势。OIE认定RHDV2型毒株为兔出血症病毒的第二个血清型。2020年笔者所在团队首先发现并报道了GI.2(RHDV2)在我国暴发，该毒株与中国GI.1型RHDV毒株的同源性低于85%，在致病性方面，与RHDV1相比，RHDV2更具危害性，不仅能够感染不同日龄的家兔，还能感染不同品种的野兔，感染兔病死率可达90%。在遗传特性及抗原性方面，RHDV2与RHDV1也存在较大差异，传统毒株的疫苗对新型RHDV2毒株的交叉保护作用较弱，自2020年至今，RHDV2已在我国广泛流行，严重危害养兔业。本研究获得表达我国RHDV2 SC毒株VP60蛋白的重组杆状病毒，并以该毒种为疫苗毒种研制获得RHDV2 SC株基因工程疫苗。

1 材料与方法

1.1 菌毒种

兔出血症病毒2型SC株(GenBank No. MT383749)和兔出血症病毒1型WF株，由笔者所在实验室鉴定、保存；大肠杆菌DH10Bac、Sf9昆虫细胞由笔者所在实验室保存。

1.2 主要试剂

总RNA提取试剂RNAiso Regent、AMV反转录酶、RⅠ酶、dⅢ酶购自大连宝生物工程有限公司；培养昆虫细胞的无血清培养基IB905；RHDV单克隆抗体6B3由笔者所在实验室保存。

1.3 RHDV2 VP60基因的扩增

根据兔出血症病毒2型SC株(GenBank No. MT383749)的基因序列，设计引物序列：设计合成上游引物P1：5′-A T A G A A T T C A T G G A G G G C A A A G C C C G C-3′；下游引物P2：5′-G C A A G C T T T C A G A C A T A A G A A A A A C-3′。上游引物引入RⅠ酶切位点，下游引物引入dⅢ酶切位点。抽提RHDV2的病毒RNA，经反转录获得cDNA，并以cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增目的基因，最终利用核酸电泳鉴定目的条带。

1.4 重组转移载体pFastBacTM1-RHDV2-VP60的构建及鉴定

利用RⅠ和dⅢ分别酶切pFastBac1和 目的基因，T连接酶将载体与目的基因进行连接，连接后产物转化DH5α，涂布平板，挑取单菌落，抽提重组质粒，并对其进行双酶切鉴定，最终获得含有目的基因的重组转移载体，命名为：pFastBac1-RHDV2-VP60。

1.5 重组穿梭质粒的构建及鉴定

将上述获得的重组转移载体转化至DH10Bac中，取适量培养菌液涂于含有卡那霉素、庆大霉素、四环素以及-和IPTG的平板上，培养2 d后，挑取白色的单菌落，再次接种相同条件平板上进行菌落纯化，再次挑取白色单菌落，接种于含卡那霉素、庆大霉素和四环素的液体培养基中，37 ℃ 振摇培养24 h，抽提重组杆状病毒穿梭质粒，并以通用pUC/M13上、下游引物对质粒进行PCR鉴定，命名为Bacmid-RHDV2-。

1.6 重组RHDV2 VP60杆状病毒的获得

利用转染试剂将Bacmid-RHDV2-VP60转染生长状态约80%的单层昆虫细胞，培养3 d，逐日观察病变情况，待细胞出现典型病变后，收获细胞培养物，获得重组杆状病毒原液。

1.7 重组RHDV2 VP60蛋白的表达及鉴定

1.7.1 Western blot鉴定 对制备获得的重组蛋白表达产物进行电泳、转印和免疫印迹分析，并以接种野生型杆状病毒的细胞培养物为空白对照，利用抗RHDV2特异性单抗6B3为一抗，羊抗鼠HRP-IgG为二抗，对表达的重组蛋白进行Western blot鉴定。

1.7.2 血凝效价检测 对制备获得的重组蛋白表达产物进行血凝效价检测，按照红细胞凝集试验96孔试验操作测定重组蛋白的血凝效价。

1.7.3 电镜观察 对制备获得的重组蛋白表达产物进行纯化，将样品置于铜网静置2 min，再加入2%磷钨酸染液进行固定，最后利用透射电镜观察和拍照。

1.8 RHDV2 SC株VP60基因工程疫苗的制备

利用悬浮培养的昆虫细胞，待细胞生长为对数生长期时，接种重组杆状病毒，观察细胞生长状态和病变进程，病变细胞数量达约85%时取样，利用凝集试验和Western blot方法对重组蛋白进行鉴定。根据血凝效价水平，取适量重组蛋白，并按照抗原 ∶氢氧化铝胶质量比9 ∶1配制疫苗，最终获得RHDV2 SC株基因工程疫苗。用同样的方法制备抗原含量相同的传统RHDV WF株基因工程疫苗，用于评价交叉保护作用。

1.9 疫苗的免疫效力评价

选用兔出血症病毒抗原、抗体均为阴性的2～3月龄家兔60只，设置免疫4组，对照2组，10只/组。取免疫组2组，对照组1组，分别接种RHDV2 SC株基因工程疫苗1.0 mL/只，传统RHDV WF株基因工程疫苗1.0 mL/只，对照接种生理盐水1.0 mL/只，分别于免疫后21 d，颈部皮下注射兔出血症病毒2型SC株1.0 mL(含病毒1 000 LD)，观察7 d。另取免疫组2组，对照组1组，分别接种RHDV2 SC株基因工程疫苗 1.0 mL/只，传统RHDV WF株基因工程疫苗1.0 mL/只，对照接种生理盐水1.0 mL/只，分别于免疫后21 d，颈部皮下注射兔出血症病毒1型WF株1.0 mL(含病毒 1 000 LD)，观察7 d。

2 结果与分析

2.1 重组转移载体的酶切鉴定

利用PCR扩增获得RHDV2-基因(图1)，并成功克隆至pFastBac1质粒中。构建成功重组质粒pFastBac1-SC-VP60，双酶切鉴定结果显示，分别以RⅠ和dⅢ进行酶切，结果显示，酶切后出现4 800 bp和1 740 bp左右的2个片段(图2)，说明重组转移载体构建成功。

2.2 重组穿梭质粒的PCR鉴定

利用重组Bacmid DNA为模板，利用pUC/M13上、下游引物对重组质粒进行PCR扩增，结果显示扩增产物大小约为4 300 bp (阳性大小为2 560 bp+目的基因)，证明转座成功，重组穿梭质粒Bacmid-SC-VP60构建成功(图3)。

2.3 重组兔出血症病毒2型VP60杆病毒的获得

将重组穿梭质粒Bacmid-SC-VP60转染昆虫细胞，培养3 d后，逐日观察病变情况，直至细胞出现典型变大变圆的病变特征，同时对照细胞正常生长时，收获重组兔出血症病毒2型VP60杆状病毒，命名为rBAC-RHDV2-VP60株。

2.4 重组兔出血症病毒2型VP60杆状病毒的鉴定

2.4.1 Western blot鉴定 以抗RHDV2 特异性单抗6B3为一抗，结果提示重组杆状病毒接种昆虫细胞后，表达获得了特异性重组蛋白VP60，大小为 60 ku(图4)。同时，接种野生型杆状病毒的细胞产物无特异性条带，结果提示VP60蛋白获得有效表达。

2.4.2 红细胞凝集效价测定 接种重组兔出血症病毒2型VP60杆状病毒后收获细胞培养物，测定红细胞凝集效价，结果显示，表达获得的重组蛋白对人的红细胞凝集效价结果为1 ∶4 096。

2.4.3 电镜观察 重组杆状病毒接种昆虫细胞后，表达获得高水平的重组蛋白，该蛋白可形成大小约36 nm、形态和结构类似天然病毒RHDV2的病毒样颗粒(图5)。

2.5 RHDV2 SC株VP60基因工程疫苗的免疫效力检测

利用RHDV2 SC株基因工程疫苗和传统RHDV WF株基因工程疫苗分别免疫实验兔，免疫后21 d，攻毒兔出血症病毒2型SC株1.0 mL(含病毒1 000 LD)，结果(表1)显示，对照组兔全部死亡，免疫RHDV2 SC株基因工程疫苗兔全部健康存活，免疫传统RHDV WF株基因工程疫苗兔死亡6只，保护率仅为40%。

表1 疫苗免疫保护效果检测(SC株攻毒)

免疫后21 d，攻毒兔出血症病毒1型WF株 1.0 mL(含病毒1 000 LD)，结果(表2)显示，免疫传统RHDV WF株基因工程疫苗兔全部健康存活，对照组兔全部死亡；免疫RHDV2 SC株基因工程疫苗兔死亡7只，保护率仅为30%。 结果说明RHDV2 SC株基因工程疫苗能够有效保护兔出血症病毒2型SC株的攻击，而传统RHDV型WF株疫苗不能对国内流行毒株RHDV2 SC毒株产生有效的免疫保护，RHDV2 SC株基因工程疫苗也不能对国内传统RHDV毒株产生有效的免疫保护，两型毒株间交叉保护作用较低。

表2 疫苗免疫保护效果检测(WF株攻毒)

3 讨论与结论

当前新型RHDV2毒株已经在全国多地流行和暴发，变异毒株与RHDV传统毒株在遗传特性、免疫保护相关基因、对宿主的易感性等方面均发生了高度的变异，新型毒株能够逃逸传统毒株诱导的宿主免疫应答，且与RHDV传统毒株相比，新型毒株感染宿主谱更广，并出现了跨宿主传播的现象。RHDV具有高度变异的特点，同时也具有毒株间高频的基因重组特性，因此，该病毒对公共卫生安全存在重大的潜在威胁，加强病毒的监测对维护养兔生产和公共卫生安全具有重要的意义。

兔出血症以高发病率高死亡率为特征，死亡率高达90%。自2010年RHDV2首次在法国报道后，研究已证实经典型RHDV的疫苗不能够对RHDV2毒株提供有效的交叉保护作用，因此急需研制高效的针对我国流行毒株RHDV2型的疫苗。研究构建重组RHDV2 SC毒株VP60杆状病毒，并以此重组杆状病毒为疫苗毒种，制备获得到了兔RHDV2 SC株基因工程疫苗。疫苗的免疫效力实验结果显示，RHDV2 SC株基因工程疫苗对RHDV2的保护效力为100%，具有良好的免疫效力。然而免疫传统RHDV WF株基因工程疫苗的保护率仅为40%，本研究研制的基因工程疫苗对防控我国目前流行的RHDV2型毒株方面具有重要的意义，能够保证我国家兔产业的健康发展。