高分辨气相色谱-高分辨质谱法(HRGC/HRMS)分析环境样品中二噁英类物质前处理技术探讨

冉艳琼,曹 阳,黄 芸，鲜文婷,熊 杰

(四川省生态环境监测总站,成都 610091)

前 言

二噁英实际上是二噁英类(Dioxins)一个简称，是一种在环境中可持久性存在的有机污染物(POPs)，其化学、物理、生物学降解周期较长，通常需要几十年或更长时间。二噁英类的毒性因氯原子的取代数量和取代位置不同而有差异，含有1～3个氯原子的被认为无明显毒性；含4～8个氯原子的有毒，其中2,3,7,8-T4CDD毒性最大(其毒性相当于人们熟知的剧毒物质氰化物的130倍、砒霜的900倍)[1]。再随着氯原子取代数量的增加，其毒性又将会有所减弱。对二噁英类的毒性进行评价时，国际上常把各同类物折算成相当于2,3,7,8-T4CDD的量来表示，称为毒性当量(Toxic Equivalent Quantity，简称TEQ)。二噁英不易溶于水，极易溶于脂肪组织，可通过母乳和动植物吸收而直接侵害人体[2]，且二噁英具有致畸、致癌、致突变效应和生殖毒性[3]。在《斯德哥尔摩公约》已经控制的 20 多种 POPs 中，二噁英是公认毒性最强的污染物，是公约首批控制的12 种污染物之一。二噁英同时存在含量低(痕量与超痕量分析)、多组分分析、异构体繁多，分析技术特异性高、难度大等因素[4]，全世界都急需高效的检测手段来监测和控制环境中的二噁英含量。

目前环境样品中的二噁英类检测方法主要分为化学检测法、生物检测法、免疫法[5]。国际公认的二噁英检测方法高分辨气相色谱-高分辨质谱法(HRGC -HRMS)因分辨率高、检出限低、精密度好应用广泛，其中美国的 EPA1613 法现为各国公认的仲裁方法[6]。高分辨气相色谱-高分辨质谱法的主要步骤为：提取-浓缩-净化-浓缩-定容-上机测试[7]，而这其中提取和净化这两步是极为关键，对二噁英类物质分析的准确性起至关作用，同时不同的前处理方法，分析准确度，分析周期，耗费人力都不尽相同。而现阶段二噁英的分析普遍存在分析前处理过程中技术难度大、周期长、试剂用量大、操作安全性等相关问题。本文主要针对高分辨气相色谱-质谱法分析二噁英类物质的前处理技术中最为关键的提取、净化的不同方法进行了综合比较试验，提出更加简便、高效、准确、安全的前处理技术方案，为二噁英类物质分析提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

本实验采用高分辨气相色谱-高分辨质谱法(HRGC/HRMS)对前处理后的样品进行分析。所需仪器设备有： Thermo DFS高分辨气相色谱-质谱仪、索式提取装置、ASE350快速溶剂萃取仪(Thermo)、全自动净化仪(德国LCTech)、半自动净化仪、氮吹浓缩仪(Organomation)。所需试剂耗材有：多层硅胶柱(德国LCTech)、氟罗里硅土柱(德国LCTech)、活性炭柱(德国LCTech)、二氯甲烷(农残级)、正己烷(农残级)、甲苯(农残级)、丙酮(农残级)、壬烷(农残级)、浓硫酸(优级纯)、硅藻土、中性硅胶(CNW)、活性炭、EPA1613 ISS混合标准样品(13C-1,2,3,4-TCDD 和13C-1,2,3,7,8,9-HxCDD进样内标)、EPA1613 LCS混合标准溶液(含15个13C标记的2,3,7,8-氯取代PCDD/Fs提取内标)、EPA 1613 CS1-CS5校正标准溶液、仪器参考标样全氟三丁胺(FC43)。

1.2 实验方法

目前环境样品中二噁英分析的行业标准中二噁英前处理方法方式单一和繁琐且存在周期长、试剂用量大、操作安全性等相关问题。其具体步骤为在样品中加入EPA1613 LCS混合标液，使提取内标的加标量为：四氯～七氯代化合物0.5ng，八氯代化合物1.0ng进行提取，经提取后的样品需通过净化去除基体干扰，将净化后的样品浓缩至近干，加入30μL正壬烷和5μL进样内标EPA1613 ISS(1.0ng)定容至35μL，最后采用高分辨气相色谱-质谱仪进行上机分析。目前环境分析实验室常用提取样品方法选用美国赛默飞DionexASE350快速溶剂萃取仪和索式提取仪两种方式进行提取，本实验采用两种提取方法分别测定8个土壤标准样品，比较17种二噁英类化合物结果准确度及15种二噁英类提取内标回收率，综合提出更优的样品提取方法。常用的净化样品方法有三种：一种是采用LcTech的全自动净化仪和成品柱，一种是采用手工填充的手动净化，还有一种为半自动净化。本实验室采用某垃圾焚烧厂周边实际土壤样品，经加压流体萃取后，采用三种净化方法进行比对试验。

快速溶剂萃取条件：二噁英快速溶剂萃条件为：萃取池压力：1500psi、加热温度：150℃、预加热平衡时间：7min、静态萃取时间：7min、溶剂淋洗体积：100%池体积、氮气吹扫时间：200s、静态萃取次数：3次，萃取溶剂为甲苯约,80mL，单个萃取时间为35min以内。

索式提取条件：称取一定量的土壤样品至于滤筒中，放入索氏提取管，在平底烧瓶中加入350mL甲苯溶剂，采用电炉加热试剂循环浸提的方式，回流18～24h。

LCTech全自动净化条件：根据净化柱数量可分为三柱式、四柱式净化，以常见的四柱式净化为例，第一段为多层硅胶柱，含有碱性硅胶、中性硅胶、酸性硅胶等，其中酸性硅胶柱能够有效地吸附样品中强极性化合物，多环芳香族化合物、有色物质等，而经过多层硅胶柱的样品中的二噁英类、呋喃类化合物以及PCBs等通过正己烷将分离样品中的PCB并吸附在第一活性炭柱上；第二段为弗罗里硅土柱，样品经过弗罗里硅土柱并在二氯甲烷/正己烷(1∶1,V/V)混合溶剂的作用下将PCDD/PCDF附着在第二活性炭柱上；第三段为第一活性炭柱，用二氯甲烷/正己烷(1∶1,V/V)混合溶剂洗脱部分PCB化合物，并用甲苯溶剂反冲第一活性炭柱再次分离PCB化合物，第四段为第二活性炭小柱，用甲苯溶剂反冲第二活性碳小柱洗脱PCDD/PCDF，并收集洗脱液。整个过程全部自动化，并由仪器精准控制流量，每净化一个样品仅需要60～70min。

半自动净化条件：半自动净化采用成品柱，不需要手工填充净化柱。第一步用40mL正己烷预淋洗酸性硅胶层析柱，将预淋洗好的酸性硅胶层析柱与活性炭柱串联，并用10mL正己烷淋洗，第二步将样品用正己烷转移至串联酸性硅胶层析柱/活性炭柱，每次用2mL正己烷洗涤容器(3～4次)，并将洗涤液转移至串联酸性硅胶层析柱/活性炭柱上，再用15mL正己烷淋洗串联酸性硅胶层析柱/活性炭柱(弃去过柱正己烷)后，用15mL正己烷洗脱DL-PCBS和PBDES，第三步将活性炭柱与酸性硅胶层析柱分离，连接在另一空玻璃柱下方(活性炭平整面向上)，用6mL甲苯/正己烷(1∶1)洗脱DL-PCBS和PBDES，最后再将活性炭柱翻转与空玻璃柱连接，用30mL甲苯洗脱PCDDS/FS，收集洗脱液。全过程也需要实验人员把控好每一步，每批样品净化需要8h左右。

手工填充的手动净化条件：目前应用也比较广泛，手动净化需要在实验室自行制作填料，装填净化柱。各实验室装填方式大致相同。本实验手动净化填充净化分为两大部分组成，一部分为多层硅胶柱，另一部分为活性炭柱，见图1。净化步骤为先用150mL正己烷以每秒1～2滴的速度活化多层硅胶柱，再用150mL正己烷以相同的速度进行洗脱。洗脱以后的样品经浓缩待用。再30ml正己烷以每秒1～2滴的速度活化活性炭柱，用二氯甲烷/正己烷(1∶1,V/V)混合溶剂将多层硅胶洗脱浓缩后的样品进行再次洗脱，翻转活性炭柱后再用50mL甲苯洗脱二噁英。全程均需要实验人员把控好每一步，每批样品净化需要8h左右。

图1 手动填充净化柱示例Fig.1 Example of manually filled purification column

2 结果与讨论

2.1 快速溶剂萃和索式提取两种样品提取方法的综合比较

按照快速溶剂萃取条件和索式提取条件，对土壤标准样品分别测定8次，用分析结果与标准样品的相对误差值来评价提取方法的正确度，如图2；用15种二噁英类提取内标回收率来评价提取方法的提取效率，如图3。

图2 两种提取方式正确度比较Fig.2 The accuracy comparison of the two extraction methods

图3 两种提取方式二噁英类物质提取内标回收率比较Fig.3 Comparison of internal standard recovery of dioxins by two extraction methods

由图2可见，采用快速溶解萃取或索氏提取两种提取方法对二噁英类土壤标准样品进行测定准确度分别在-0.8～4.5和-9.6～19.3之间，均在±20%以内。由图3可见，提取内标的回收率大小并无明显区别且均在72%以上。但是采用美国赛默飞DionexASE350快速溶剂萃取仪，试剂用量少(小于80mL)，可连续提取几十个样品，且单个样品萃取时间短(35min以内)。

综上所述，加压流体萃取和索式提取两种方式的提取效率基本一致，但加压流体萃取相比索氏提取试剂用量更少，前处理周期更短，实验室安全性能更高。

2.2 LCTech全自动净化方法、手工填充的手动净化方法、半自动净化方法的综合比较

以实际土壤样品为例经提取后的样品按照全自动净化、手动净化及半自动净化分别测定8个平行样品，以15种二噁英提取内标回收率测定均值来评价净化方法的准确度，如图4；以质谱图和FC43提取离子图的评价净化方法的净化效果，三种净化方法的质谱图和FC43提取离子图均如图5、图6。

图4 三种净化方式15种同位数标记二噁英内标回收率对比Fig.4 The internal recovery comparison of 15 isotopes labelling dioxin by three purification methods

由图4可见：采用全自动净化时15种同位数标记二噁英提取内标回收率在79%～107%之间，五氯代二苯并-对-二噁英和六氯代二苯并-对-二噁英的回收率要优于其他物质；采用手动净化

1—2,3,7,8-T4CDF、13C122,3,7,8-T4CDF；2—13C121,2,3,4-T4CDF；3—2,3,7,8-T4CDD、 13C12-2,3,7,8-T4CDD；4—1,2,3,7,8-P5CDF、13C121,2,3,7,8-P5CDF；5—2,3,4,7,8-P5CDF、13C122,3,4,7,8-P5CDF；6—1,2,3,7,8-P5CDD、13C121,2,3,7,8-P5CDD；7— 1,2,3,4,7,8-H6CDF、13C12-1,2,3,4,7,8-H6CDF；8—1,2,3,6,7,8-H6CDF、13C12-1,2,3,6,7,8- H6CDF；9—2,3,4,6,7,8- H6CDF、13C12-2,3,4,6,7,8- H6CDF；10—1,2,3,4,7,8-H6CDD、13C12-1,2,3,4,7,8-H6CDD；11—1,2,3,6,7,8-H6CDD、13C12-1,2,3,6,7,8-H6CDD；12—1,2,3,7,8,9-H6CDD、13C12-1,2,3,7,8,9-H6CDD；13—1,2,3,7,8,9-H6CDF、13C12-1,2,3,7,8,9-H6CDF；14—1,2,3,4,6,7,8-H7CDF、13C12-1,2,3,4,6,7,8-H7CDF；15—1,2,3,4,6,7,8-H7CDD、13C12-1,2,3,4,6,7,8-H7CDD；16—1,2,3,4,7,8,9-H7CDF、13C12-1,2,3,4,7,8,9-H7CDF；17—OCDD、13C12-OCDD；18—OCDF图5 高分辨气相色谱-高分辨质谱法(HRGC-HRMS)测定质谱图Fig.5 The mass spectrum by HRGC-HRMS

图6 高分辨气相色谱-高分辨质谱法(HRGC -HRMS)测定FC43提取离子图Fig.6 FC43 Extracted ion diagram by HRGC-HRMS

时同位数标记二噁英内标回收率在63%～96%之间，五氯代二苯并-对-二噁英的回收率要优于其他物质；采用半自动净化时二噁英类提取内标回收率在63%～83%之间。因此采用图5可见，通过三种净化方式后的样品分析后均物质峰分离度好，无拖尾峰；由图6可见，提取离子图基线平顺、无负峰、无突出峰、杂质较少。

综上所诉三种净化方式的净化效果程度一致，但全自动净化方式的回收率整体上优于手动净化和半自动净化，且全自动净化耗时较短，不需要过多的人工操作，对于经费预算足且分析技术员缺乏的单位是较好的一种前处理方式，而手动净化和半自动净化的回收率基本接近，原因可能是全自动净化是采用仪器精准控制活化及洗脱的流速和压力，成品填充柱的填充松紧度也相对紧实及均匀。而手动净化和半自动净化均由操作人员自行调节活化及控制洗脱的流速和压力，会因为不同操作者熟练程度而产生的较大的系统误差，同时实验室自行填充的净化柱也会受不同操作者的影响较大。

3 结 论

本文通过对用高分辨气相色谱-高分辨质谱法(HRGC/HRMS)分析环境样品中实验室常用的几种前处理方法进行充分的比对试验，试验表明采用快速溶解萃取和全自动净化方法相结合的方式进行前处理，操作简单、前处理效率高、数据准确性高，能够更简便、高效、准确、安全的进行环境样品中二噁英类物质的前处理。为环境类样品二噁英分析的前处理提供技术方案，极大的弥补了行业标准中前处理方式单一的缺陷，为广泛的开展二噁英分析工作，推进二噁英技术研发，改进二噁英类污染监测技术起到重要的支撑作用，从而为进一步的二噁英综合防治奠定更加坚实的技术基础。