KOH和NH3·H2O联合固态预处理对青稞秸秆厌氧发酵特性的影响

柳 丽，李 洁，白羿雄，杜中平，李 屹，陈来生，韩 睿*

1. 青海大学农林科学院，青海省蔬菜遗传与生理重点实验室，青海 西宁 810016

2. 青海省农林科学院，青海 西宁 810016

青稞(Hordeum vulgareL. var.nudumHook. f.)是我国青藏地区种植面积最广的粮食作物之一，占该地区总粮食作物种植面积的43%[1]. 青稞秸秆作为青稞收获后的副产品，在青海省年产量已达30×104t，资源量十分丰富，但大部分青稞秸秆却未能得到有效利用，就地填埋和焚烧的现象仍普遍存在，造成极大的资源浪费和环境污染. 厌氧发酵是一种有效的有机固废处理技术，不仅可以实现秸秆等农业废弃物减量化，还能生产出清洁能源[2-3]. 然而，直接利用青稞秸秆进行厌氧发酵却存在两个缺点：一是秸秆中紧密的木质纤维素结构严重阻碍了底物的水解速度和发酵效率，二是秸秆过高的碳氮比也会抑制甲烷生成[4-5]. 因此，降低秸秆中木质纤维素之间的聚合度、优化发酵系统的碳氮比对于提高青稞秸秆厌氧发酵性能至关重要.

预处理技术是提高秸秆等农业废弃物厌氧发酵效率的有效手段，其中碱法处理是最为高效的预处理方法之一[6-7]. 相对于其他碱处理试剂，KOH更能够被回收利用. 例如：Liu等[8]研究发现，KOH预处理可以显著提高玉米秸秆的甲烷产率，并且预处理过程中添加的大部分K+也能在发酵液中得到保存；Moset等[9]研究发现，KOH不仅可以提高麦草的生物降解性，还能提高发酵液肥料价值. 虽然上述单一KOH预处理可以提高秸秆的厌氧发酵性能，但却无法调节系统中的碳氮比，因此需要补充额外的氮. Wang等[10]指出，在奶牛垫草热预处理过程中添加NH3·H2O可以为体系增加氮源，提高甲烷产量；Yuan等[11]发现，NH3·H2O预处理具有增加氮含量和调节碳氮比等优点，有助于提高玉米秸秆厌氧发酵产甲烷能力. 然而，

利用KOH和NH3·H2O联合预处理秸秆类废弃物的研究鲜有报道. 与单一的碱处理相比，KOH和NH3·H2O联合预处理不仅能够有效降解秸秆中结构紧密的木质纤维素，还能为发酵系统补充氮源，改善发酵环境[10-13]. 此外，预处理期间添加的K元素和N元素也能够保留在发酵后的沼渣沼液中，并可作为钾肥和氮肥使用，增加土壤肥力，从而减少回收预处理剂的成本，降低对环境的污染[14-16].

现阶段，秸秆厌氧发酵的化学预处理技术大多都伴随着固液分离和废液排出所带来的额外成本和环境污染等问题，极大地限制了秸秆厌氧发酵的工程化应用. 为了在更有效提高青稞秸秆厌氧发酵性能的同时，能够进一步降低其对环境的污染，该研究选用KOH和NH3·H2O对青稞秸秆进行联合固态预处理，探讨不同含量的KOH和NH3·H2O及预处理时间对厌氧发酵累积甲烷产量的影响，并通过建立响应面模型得到各因素之间的交互作用以及青稞秸秆厌氧发酵最优预处理条件，同时对比分析最优预处理条件下厌氧发酵的产甲烷性能和发酵液的营养价值，以期为青稞秸秆的资源化利用提供理论依据和参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

青稞秸秆取自青海大学农林科学院实验地，自然条件下风干后，用粉碎机粉碎至粒径2 cm左右，于阴凉通风处保存备用. 接种物取自青海知源特色农业有限责任公司以牛粪为原料运行稳定的农用沼气池. 接种物取回后，(35±0.5)℃下厌氧培养1~2周至不再产气以减小背景甲烷产量，将其用作试验接种物. 发酵原料和接种物的特性见表1.

表1 原料与接种物特性Table 1 Characteristics of raw materials and inoculum

1.2 预处理试验

前期预试验研究发现，当预处理时间为24 h时，7% KOH和5% NH3·H2O单一预处理均能对青稞秸秆厌氧发酵性能起到较好的提升作用. 进行联合预处理时，考虑到试验的适用性和可行性，在上述单一预处理基础上，以KOH含量(2%、4%、6%)、NH3·H2O含量(1%、3%、5%)和处理时间(12、24、36 h) 3个因素作为联合预处理自变量，预处理后青稞秸秆厌氧发酵累积甲烷产量为响应值，采用Box-Behnken法设计三因素三水平的响应面法优化试验，试验因素与水平见表2. 同时，将7% KOH和5% NH3·H2O单一处理24 h的青稞秸秆(分别记为Q和S)与优化条件处理后的青稞秸秆(记为QS)进行对比，并采用未经任何处理的青稞秸秆作为对照(记为CK). 上述预处理系统含水率均设定在70%左右，将配制好的混合溶液与青稞秸秆充分搅拌均匀后放置在广口瓶内，密封并置于室温下处理.

表2 试验因素与水平Table 2 Test factors and levels

1.3 厌氧发酵试验

厌氧发酵试验采用全自动甲烷潜力测试仪〔MultiTalent 203，碧普华瑞环境技术(北京)有限公司〕.将500 mL标准批式进料反应器置于恒温〔(35±0.5)℃〕水浴锅中，设定每隔3 min搅拌一次，每次搅拌时长为0.5 min. 预处理完成后，按照接种物与青稞秸秆的VS接种比为2:1，分别在不同发酵瓶中加入对应含量的青稞秸秆与接种污泥，并设置只添加接种污泥的空白处理. 各处理组物料添加的总质量为400 g，发酵周期为30 d. 每组均设置3个重复.

1.4 测定项目及方法

总固体(TS)和挥发性固体(VS)含量采用烘干法测定，其中，总固体于烘箱105 ℃下烘24 h，挥发性固体于马弗炉550 ℃下灼烧3 h；木质纤维素含量由纤维测定仪〔F800型，山东海能科学仪器(中国)有限公司〕参照NY/T 1459−2007《饲料中酸性洗涤纤维的测定》、GB/T 20806−2006《饲料中中性洗涤纤维(NDF)的测定》和GB/T 20805−2006《饲料中酸性洗涤木质素(ADL)的测定》测定；全氮含量采用硫酸-催化剂消解法测定[17]；全磷和全钾含量分别采用NaOH熔融法-钼锑抗比色和火焰光度法测定[18]；傅里叶红外光谱(FTIR)采用固体溴化钾压片法进行分析[19].

1.5 数据处理方法

采用SPSS Statistics 22软件分析数据，采用邓肯多重比较法，当P<0.05时，数据之间具有显著性差异；利用Design-Expert 12软件进行数据拟合与分析；使用Origin 2018制图.

2 结果与讨论

2.1 响应面模型及方差分析

Box-Behnken试验设计及其结果如表3所示. 将青稞秸秆厌氧发酵累积甲烷产量(Y)设定为响应值，用Design-Expert 12软件对数据进行多元线性回归拟合，从而得到累积甲烷产量(Y)对KOH含量(A)、NH3·H2O含量(B)、预处理时间(C)的响应面模型：

表3 Box-Behnken试验设计及对应的试验结果Table 3 Box-Behnken design and test results

由表4可见，响应面模型显著(P<0.05)，但失拟项表现不显著(P>0.05)，R2=0.949 4，F=14.59，表明该模型能够对青稞秸秆的累积甲烷产量进行分析与预测，且拟合效果较好. 由各因素的P值可知，KOH含量(A)、NH3·H2O含量(B)为显著影响因素，预处理时间(C)为不显著影响因素；A、C交互作用显著，A、B和B、C交互作用不显著；A2、B2曲面效应显著，C2曲面效应不显著. 由模型一次项及F值可知，各因素对累积甲烷产量的整体影响程度表现为NH3·H2O含量>KOH含量>预处理时间.

表4 响应面模型的方差分析Table 4 Variance analysis for the response surface model

2.2 响应面优化分析

利用Design-Expert 12软件绘制响应面模型的三维曲面图，考察不同因素之间的交互作用对累积甲烷产量的影响. 由图1~3可知，在试验设定的自变量范围内，KOH含量(A)、NH3·H2O含量(B)、预处理时间(C)均存在极值点，说明三者范围设置比较恰当，拟合曲面的最大值是真实存在的.

由KOH含量和预处理时间交互作用对青稞秸秆累积甲烷产量影响的响应曲面图(见图1)可知，在NH3·H2O含量为3%条件下，当预处理时间一定时，随KOH含量的增大，累积甲烷产量呈现先升高后降低的趋势. 这说明适宜的KOH含量能够有效提高青稞秸秆厌氧发酵产甲烷能力，含量过低则产甲烷性能提升效果不明显，含量过高又可能会抑制微生物活性，影响产甲烷效果[20-21]. 同时，适量的K+也可以刺激产甲烷菌的活性，提高甲烷产量[15]. 当KOH含量一定时，累积甲烷产量随着预处理时间的延长呈现先升高后降低的趋势. 这说明适宜的预处理时间能够有效降解秸秆中的木质纤维素，有益于产甲烷菌生存；预处理时间过长则会过度破坏秸秆的有效成分，进而影响纤维素的酶解效率[22]. 从图1还可以看出，最高累积甲烷产量出现在KOH含量为5%~6%、预处理时间为12~18 h范围内. KOH含量的变化坡度较预处理时间的变化坡度更陡，曲线越陡说明因素对响应值(Y)的影响越大，可见KOH含量较预处理时间对累积甲烷产量的影响更加显著.

图1 KOH含量和预处理时间交互作用的响应面Fig.1 Response surface diagram of interaction between KOH concentration and pretreatment time

由NH3·H2O含量和KOH含量交互作用对青稞秸秆累积甲烷产量影响的响应曲面图(见图2)可知，在预处理时间为24 h条件下，当KOH含量一定时，累积甲烷产量随着NH3·H2O含量的增加呈现先升高后降低的趋势. 这表明适宜含量的NH3·H2O不仅能够有效降解秸秆中的木质纤维素，还能够为发酵系统提供氮源、调节碳氮比，促进体系产甲烷性能. NH3·H2O含量过低时不能对青稞秸秆进行有效降解，含量过高则可能会产生氨抑制，影响产甲烷菌活性和发酵效率[23-24]. 当NH3·H2O浓度一定时，累积甲烷产量随着KOH含量的升高呈现先升高后降低的趋势. 从图2还可以看出，最高累积甲烷产量出现在KOH含量为5%~6%、NH3·H2O含量在3%~4%范围内；并且当NH3·H2O含量和KOH含量均处于最低水平时，累积甲烷产量亦最低. 同时，NH3·H2O含量的变化坡度较KOH含量的变化坡度更陡，说明NH3·H2O含量对累积甲烷产量的影响更加显著.

图2 NH3·H2O含量和KOH含量交互作用的响应面Fig.2 Response surface diagram of interaction between NH3·H2O concentration and KOH concentration

由NH3·H2O含量和预处理时间交互作用对青稞秸秆累积甲烷产量影响的响应曲面图(见图3)可知，在KOH含量为4%条件下，当NH3·H2O含量一定时，随着预处理时间的延长，累积甲烷产量呈现先升高后降低的趋势；当预处理时间一定时，累积甲烷产量随着NH3·H2O含量的升高呈先升后降的趋势. 从图3还可以看出，最高累积甲烷产量出现在预处理时间和NH3·H2O含量分别为12~18 h和3%~4%的范围内. NH3·H2O含量的变化坡度比预处理时间的变化坡度更陡，表明NH3·H2O含量对累积甲烷产量的影响更加显著.

图3 NH3·H2O含量和预处理时间交互作用的响应面Fig.3 Response surface diagram of interaction between NH3·H2O concentration and pretreatment time

综上，NH3·H2O含量对青稞秸秆厌氧发酵积累甲烷产量的影响较大，这与表4所示方差分析结果一致. 经Design-Expert 12软件优化得到青稞秸秆厌氧发酵的最优工艺条件为KOH含量5.13%、NH3·H2O含量3.35%、预处理时间13.87 h，该条件下累积甲烷产量最大预测值为286.4 mL/g.

2.3 响应面验证试验

采用最优组合条件(KOH含量为5.13%、NH3·H2O含量为3.35%、预处理时间为13.87 h)进行3次重复厌氧发酵试验，用以验证响应面模型的有效性和准确性. 试验得到的累积甲烷产量平均值为282.34 mL/g，与预测值(286.4 mL/g)非常接近，相对误差小于5%，说明该验证模型有效.

2.4 对比试验

2.4.1 日产甲烷量和累积甲烷产量

由图4(A)可知，在30 d的厌氧发酵过程中，对照(CK)、单一预处理(Q和S)和优化条件处理(QS)的日产甲烷量均出现1~2个产甲烷高峰，且集中在前10 d，其中QS的日产甲烷量最大，达到154.77 mL，同时能够快速进入产甲烷阶段. 由图4(B)可知，QS、Q和S处理组累积甲烷产量较CK均显著增加(P<0.05)，其中QS的累积甲烷产量最高，分别较Q、S和CK提高了7.59%、20.82%和70.78%. 这说明KOH和NH3·H2O联合预处理平衡了发酵系统的营养成分，更能够有效提高青稞秸秆厌氧发酵的产甲烷能力，且所需的含量和时间均低于单一预处理，更具实际应用价值.

图4 日产甲烷量和累积甲烷产量Fig.4 Daily methane production and cumulative methane production

2.4.2 木质纤维组分含量的变化

不同处理组青稞秸秆木质纤维素的变化情况如表5所示. 由表5可见，与CK相比，预处理后青稞秸秆木质素、纤维素和半纤维素含量均显著下降(P<0.05)，

表5 不同处理组木质纤维素含量和营养元素含量Table 5 The content of lignocellulose and nutrient elements among different treatment groups

三者去除率分别为23.72%~29.21%、7.81%~10.92%和15.34%~21.31%. 相较而言，木质素的去除率最高，这与Liu等[8]的研究结果相符. 其中，QS处理组的木质素去除率分别比Q和S处理组提高了4.25%和8.88%，说明联合预处理的木质素降解效果优于单一预处理.

2.4.3 傅里叶红外光谱图分析

傅里叶红外光谱图(FTIR)是一种能够表征木质纤维素结构中基团和化学键的常用技术手段[25]. 从图5可以看出，预处理前后的红外光谱图形状大致相同，说明预处理后青稞秸秆的官能团及化学键种类没有发生变化，仅木质纤维素结构发生了改变，表现为某些峰的吸收强度不同. 3 475 cm−1附近为羟基(O−H)的伸缩振动峰，代表木质素的吸收强度[26]；相比CK，该吸收峰减弱，说明预处理破坏了木质素内部的基团，导致秸秆基质孔隙度增加. 其中，QS和Q处理组吸收峰减弱明显，与表5所示木质素含量分析结果一致. 2 913 cm−1附近的吸收峰是由于C−H中甲基和亚甲基对称及反对称拉伸振动引起的，代表纤维素的吸收强度[27]；预处理后该吸收峰减弱，说明在预处理作用下纤维素中部分甲基、亚甲基发生断裂，纤维素降解. 1 724和1 600 cm−1附近分别是羰基键和苯环的吸收峰，代表半纤维素和木质素的吸收强度[28-29]；预处理后两处吸收峰减弱，表明青稞秸秆中半纤维素和木质素得到有效去除. 1 035 cm−1附近的吸收峰是醚键的伸缩振动带，表示半纤维素的吸收强度[28]，此处吸收峰明显减弱，说明预处理后半纤维素降解.

图5 不同处理组的傅里叶红外光谱图Fig.5 FTIR spectra of different treatment groups

2.4.4 发酵液的营养元素含量分析

由表5可知，与未添加钾的处理组(S和CK)相比，添加钾的处理组(QS和Q)中全钾含量显著增加(P<0.05)，增加了23.73%~59.17%，这说明预处理过程中添加的钾能够有效保留在发酵液中，不会随着厌氧发酵的进行而消耗. 添加氨水的处理组(QS和S)中全氮含量比未添加氨水的处理组(Q和CK)显著增加(P<0.05)，增加了6.43%~37.45%，说明预处理过程中添加的氮元素也会有效地保留在发酵液中. 同时，各发酵液中的全磷含量(6.68~7.82 g/kg)大部分差异不显著(P>0.05)，因为每个处理组中并未额外添加磷元素. 钾和氮是增加土壤肥力和促进植物健康生长必不可少的营养元素，在发酵系统中添加钾和氮可以有效提高发酵液的营养价值[30]. 相较于单一试剂处理组，QS处理组保留了钾和氮两种营养元素，发酵液的营养价值更高，具有一定的肥料应用潜力. 由于钾能够被土壤和植物吸收利用，如果考虑将其发酵液与肥料配施土壤，不仅能够减少回收预处理试剂的成本，还能够少施化肥，降低成本.

基于此，在仅考虑KOH预处理成本和发酵液营养价值条件下对该试验最优处理进行了初步的经济效益分析. 在400 g发酵体系中，QS处理组KOH消耗量约为0.28 g，即生产1 t发酵液将消耗KOH 0.7 kg，按KOH市面价格8 000元/t计算，生产1 t发酵液成本为5.6元. QS处理组发酵液的全钾含量高出对照组5.05 g/kg，1 t发酵液能得到全钾5.05 kg. 以市面上常见钾肥−氯化钾(钾含量为52.45%)为例，推算得出生产1 t发酵液相当于能够得到9.63 kg的氯化钾. 按氯化钾市面价格5 200元/t计算，1 t发酵液能够产生50.08元的收益，减去前期预处理的投入成本，则净收益为44.48元. 相比其他碱处理试剂(如氢氧化钠)，尽管成本相对较低(氢氧化钠市面价格为4 700元/t)，但发酵液中大量存在的钠离子如果不去除很可能会造成土壤板结和微生物活性降低等多种问题，危害土壤健康[31-32]，但要去除钠离子则需要增加额外的回收成本. 综合考虑经济收益和环境污染等因素，KOH作为预处理试剂是可行的.

3 结论

a) 响应面法中的Box-Behnken试验可以很好地对青稞秸秆累积甲烷产量进行预测，响应面模型显著(P<0.05)，拟合度高，具有较高的可信度.

b) 方差分析显示，KOH含量、NH3·H2O含量和预处理时间三因素对累积甲烷产量的影响程度表现为NH3·H2O含量>KOH含量>预处理时间.

c) 通过响应面模型验证试验得到青稞秸秆累积甲烷产量最优预处理条件为KOH含量5.13%、NH3·H2O含量3.35%、预处理时间13.87 h，该条件下累积甲烷产量实测值为282.34 mL/g，与预测值(286.4 mL/g)非常接近，相对误差小于5%，证明验证模型有效.

d) 对比试验结果显示，KOH和NH3·H2O联合预处理能够显著提高青稞秸秆厌氧发酵的产甲烷能力(P<0.05)，同时能够有效降解木质素(降解率为29.21%)，提高发酵液营养价值，是高效生产生物甲烷和环境友好的木质纤维素类废弃物的处理方法.