氢氧化钠和碱性双氧水预处理对水稻秸秆酶解效果的影响

陈思哲，刘国华*，李 波，齐 鲁，王洪臣

1. 中国人民大学环境学院低碳水环境技术研究中心，北京 100872

2. 申能环境科技有限公司，江苏 杭州 311100

随着我国经济社会快速发展，以化石燃料为主的能源消费不断增加，对环境造成了极大的破坏. 近年来，生物质燃料受到学者的广泛关注. 在生物燃料研究领域中，发展较快且技术较为成熟的是谷物基乙醇的研究，谷物基乙醇的制备原料主要是甘蔗、玉米和大豆等一些传统农作物，具有一定的市场前景[1]. 然而，玉米、大豆等是我国重要的粮食作物，对维持我国社会的稳定发展尤为重要，大量使用甘蔗、玉米等粮食作物制造生物燃料，会造成我国粮食短缺的风险. 水稻秸秆是我国的主要农业废弃物，每年种植产生的水稻秸秆约为2×108t[2]，其中仅有少部分得到合理利用，废弃的水稻秸秆不仅浪费资源，也对环境造成污染[3-4]. 利用水稻秸秆作为原料制备生物燃料，可以实现资源的再生利用，同时降低对化石能源的依赖，减少环境污染问题.

水稻秸秆的主要成分为纤维素(占35%~50%)、半纤维素(占20%~35%)和木质素(占15%~20%)[5]，可以通过酶解处理使水稻秸秆降解产生可发酵性糖，用于制备生物燃料. 虽然水稻秸秆纤维素含量丰富，但是水稻秸秆作为木质纤维素原料，其纤维素成分与木质素、半纤维素成分紧密结合，使得酶分子难以与纤维素分子接触，阻碍了纤维素的酶解反应. 此外，纤维素本身结构具有许多高度结晶形态，对纤维素酶的催化水解反应速率影响较大，降低了纤维素的利用效率. 因此，为了充分使纤维素原料糖化，需要使用预处理方法破坏木质纤维素原料中木质素与半纤维素的结构，同时将纤维素的结晶形态转化为无定形态，使得其更容易被酶或微生物降解[6]. 目前常用的预处理方法有超声波与微波处理[7-8]、酸处理[9-11]、碱处理[12-13]、有机溶剂处理[14]、蒸汽爆破处理[15-17]、光催化处理[18]和生物处理[19-20]等，其中碱预处理工艺相对简单，反应条件较为温和，可以通过皂化反应破坏木质纤维素原料中纤维素与木质素、半纤维素紧密结合结构，同时使纤维素发生润胀作用，增加纤维素原料的比表面积，降低纤维素成分结晶度，促进酶解反应. 如Li等[21]研究了微波辅助氢氧化钠预处理水稻秸秆的特性，发现氢氧化钠能够显著降解水稻秸秆中的木质素成分，在微波功率为800 W下，用1%的氢氧化钠预处理1 h后，水稻秸秆糖化率达到86%；Tri等[22]研究了氢氧化钠预处理对利用竹叶生产生物乙醇的促进作用，结果表明，使用7%的氢氧化钠预处理竹叶样品后，竹叶的糖化率从41.0%提至89.5%，且1.0%氢氧化钠预处理的竹叶样品乙醇生产效率最高，转化率为38.1%；Correia等[23]在研究腰果渣用于生物乙醇生产的过程中发现，氢氧化钠和双氧水搭配使用，可以利用氢氧化钠活化双氧水的特性，提高双氧水氧化纤维素原料中的半纤维素与木质素效果，且在35 ℃的条件下，使用4.3%的过氧化氢预处理6 h后糖化效果最好，总糖回收率约为89%；Alvarez-Vasco等[24]以软木为原料，研究了碱性双氧水预处理的机理，发现碱性双氧水预处理能够去除软木原料中的大量木质素和葡甘露聚糖，同时几乎没有降解原料中的纤维素成分.

该研究对水稻秸秆分别进行氢氧化钠预处理与碱性双氧水预处理，以预处理后的水稻秸秆酶解上清液中还原糖含量作为评价指标，对氢氧化钠预处理工艺与碱性双氧水预处理工艺进行优化，通过扫描电镜、傅里叶红外光谱和X射线衍射分析方法，解析水稻秸秆预处理后的结构变化对酶解糖化效率的影响，旨在初步揭示氢氧化钠和碱性双氧水对水稻秸秆的预处理机制，为水稻秸秆的资源化利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验原料

该试验所用原料为水稻秸秆，将原料置于70 ℃烘箱中烘干24 h后粉碎，过40目(0.425 mm)筛，干燥贮存备用. 使用的纤维素酶采购自和氏璧生物科技有限公司，最佳使用温度为50 ℃，pH为4.8，酶活力为104U/g.

1.2 试验方法

碱性双氧水预处理. 称取5 g水稻秸秆，添加到装有100 mL浓度分别为0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%和1.75%氢氧化钠和浓度为1%双氧水的三角瓶中，在40 ℃的条件下，水浴处理5 h，处理后使用蒸馏水清洗水稻秸秆粉末至中性，烘干后取1 g烘干物进行酶解，酶解体系为100 mL，使用浓度为5 mol/L的柠檬酸缓冲液调节溶液pH为4.8，每g秸秆粉末中加入酶0.2 g，于50 ℃的气浴振荡箱(120 r/min)中酶解72 h后，测定上清液中的还原糖含量，采用One-way ANOVA分析(显著水平为0.05)，确定最佳氢氧化钠浓度. 在最佳氢氧化钠浓度下，配置溶液中双氧水浓度分别为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%和3%，在40 ℃的条件下，水浴处理5 h，在相同条件下对处理后的水稻秸秆进行酶解，测定上清液中的还原糖含量，确定最佳双氧水浓度. 在最佳氢氧化钠和双氧水浓度下，处理温度不变，分别以1、3、5、7、9、11 h处理水稻秸秆，在相同条件下对处理后的水稻秸秆进行酶解，测定上清液钟的还原糖含量，确定最佳处理时间. 氢氧化钠和双氧水浓度不变，在最佳处理时间下，分别在20、30、40、50、60和70 ℃的条件下处理水稻秸秆，在相同条件下对处理后的水稻秸秆进行酶解，测定上清液中的还原糖含量，确定最佳处理温度，以上每个处理重复3次.

1.3 测定方法

该试验使用二硝基水杨酸法测定还原糖含量[25].首先进行葡萄糖标准曲线的绘制，使用紫外分光光度计测定标准葡萄糖溶液在波长为540 nm下的吸光度.以葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(ABS)为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程y=0.293 2x+0.039 8(R2=0.990 9)，将紫外分光光度计测得的吸光度代入葡萄糖标准曲线，得到还原糖含量.

1.4 扫描电镜分析

取未预处理的水稻秸秆与分别经过氢氧化钠处理和碱性双氧水处理后的水稻秸秆样品分别烘干粉碎后，使用日立SU8020扫描电子显微镜(日本)进行扫描拍照，观察分析水稻秸秆在预处理前后的微观结构形态变化.

1.5 红外光谱分析

取未预处理的水稻秸秆与分别经过氢氧化钠处理和碱性双氧水处理后的水稻秸秆样品烘干粉碎，与KBr混合研磨压片后，采用美国尼高力公司iS10 FTIR spectrometer傅里叶红外光谱仪对水稻秸秆样品进行扫描分析，扫描波数范围为400~4 000 cm−1，绘制红外谱图.

1.6 X射线衍射光谱分析

取未预处理的水稻秸秆与分别经过氢氧化钠处理和碱性双氧水处理后的水稻秸秆样品分别烘干粉碎，采用德国布鲁克公司D8 ADVANCE X射线衍射仪对样品进行分析，Cu靶，工作电压为40 kV，工作电流为40 mA，扫描角度范围为5°~60°，扫描速率为4 °/min. 根据衍射图谱强度，采用Segal法计算相对结晶度，其计算公式为

式中，CrI为相对结晶度，I002为晶格衍射角的极大强度，Iam为2θ=18°时非结晶背景衍射的散射强度.

2 结果与讨论

2.1 氢氧化钠预处理对水稻秸秆酶解效果的影响

2.1.1 氢氧化钠浓度的影响

CEFTIN片用于治疗由化脓性链球菌敏感菌株引起的成人和儿童（13岁及以上）患者的轻‐中度咽炎或扁桃体炎。

如图1所示，氢氧化钠浓度在一定范围(0.5%~1.25%)内与水稻秸秆酶解效率成正比，氢氧化钠溶液中的OH−同半纤维素与木质素之间的酯键发生皂化反应，溶解水稻秸秆中的木质素，提高酶水解效果，酶解上清液中的还原糖含量由132.70 mg/g增至431.70 mg/g. 氢氧化钠浓度增至1.25%后，继续增加氢氧化钠浓度，水稻秸秆酶解效率显著下降(P<0.05)，浓度较高的氢氧化钠溶液会与水稻秸秆原料反应产生糠醛和酮类物质等副产物[26]，对水稻秸秆的酶解过程起抑制作用，使得预处理后的水稻秸秆酶解后还原糖含量降低. 综上，浓度为1.25%的氢氧化钠处理水稻秸秆最适宜.

图1 不同氢氧化钠浓度下氢氧化钠预处理水稻秸秆酶解后还原糖含量的变化Fig.1 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by different concentrations of sodium hydroxide

2.1.2 氢氧化钠预处理时间的影响

如图2所示，在最佳氢氧化钠浓度下，随预处理时间从1 h延至3 h，处理后的水稻秸秆酶解产生的还原糖含量从380.08 mg/g提至431.47 mg/g，酶解效率得到显著提升(P<0.05). 预处理时间达到3 h后，继续增加预处理时间，对水稻秸秆酶解效率的影响差异不显著(P>0.05)，在浓度和温度固定的条件下，预处理时间的增加并不能显著提高木质素和半纤维素的降解率[27]，考虑能耗与处理效果，选择3 h为氢氧化钠预处理水稻秸秆的最佳预处理时间.

图2 不同处理时间下氢氧化钠预处理水稻秸秆酶解后还原糖含量的变化Fig.2 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by sodium hydroxide under different reaction time condition

2.1.3 氢氧化钠预处理温度的影响

选用浓度为1.25%的氢氧化钠溶液，预处理3 h，考察预处理温度对水稻秸秆酶解糖化的影响. 如图3所示，在40~80 ℃的温度范围内，随着预处理温度的升高，水稻秸秆酶解效率有了显著的提高(P<0.05)，在80 ℃时，预处理水稻秸秆酶解后得到还原糖含量达到480.81 mg/g，酶解产糖率较未预处理水稻秸秆(132.70 mg/g)提高了262.3%. 当预处理温度超过80 ℃时，氢氧化钠会继续降解纤维素与半纤维素为非糖物质，影响了水稻秸秆中纤维素的利用率，预处理温度为80～90 ℃，对水稻秸秆酶解糖化效果影响不显著.因此，选择80 ℃为最佳预处理温度.

图3 不同处理温度下氢氧化钠预处理水稻秸秆酶解后还原糖含量的变化Fig.3 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by sodium hydroxide under different reaction temperature condition

2.2 碱性双氧水预处理对水稻秸秆酶解效率的影响

2.2.1 碱性双氧水中氢氧化钠浓度的优化

如图4所示，碱性双氧水预处理后，水稻秸秆酶解还原糖含量显著提升，随着氢氧化钠浓度的增加，水稻秸秆外侧的木质素和半纤维素会被进一步降解，处于内侧的纤维素大部分被保留并润胀，有利于进行酶解过程[28]. 碱性双氧水中氢氧化钠浓度为0.5%时，在40 ℃下，水浴处理5 h后，水稻秸秆酶解糖化产生的还原糖含量从未预处理的132.70 mg/g提高至464.89 mg/g，是未预处理水稻秸秆直接酶解产生还原糖含量的3.5倍. 当氢氧化钠浓度增至1.5%，水稻秸秆酶解还原糖含量达到最大值，为553.12 mg/g，继续增加碱性双氧水中氢氧化钠的浓度，水稻秸秆酶解率呈下降趋势，过高的氢氧化钠浓度会破坏内侧纤维素结构，导致有效成分流失过多. 因此，应使用浓度为1.5%的氢氧化钠制备碱性双氧水预处理水稻秸秆效果最佳.

图4 不同氢氧化钠浓度下碱性双氧水预处理水稻秸秆酶解后还原糖含量的变化Fig.4 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by alkaline hydrogen peroxide with different concentrations of sodium hydroxide

2.2.2 碱性双氧水中双氧水浓度的优化

由图5可知，在浓度为1.5%的氢氧化钠和一定范围的双氧水浓度(0.5%~2%)下，固定预处理温度40 ℃和预处理时间5 h不变，水稻秸秆酶解糖化产生的还原糖含量与双氧水浓度呈正相关，水稻秸秆酶解糖化效率得到显著提升(P<0.05)，双氧水浓度为2%时，水稻秸秆酶解糖化产生的还原糖含量达到最大，为568.58 mg/g. 双氧水可利用过氧根离子氧化作用降解木质素，同时双氧水浓度的增加能够提高氢氧化钠对水稻秸秆的润胀作用，增加水稻秸秆的比表面积，增强纤维素酶对水稻秸秆的酶解效果[29]. 当双氧水浓度超过2%时，水稻秸秆酶解糖化效率降低，过量的双氧水会造成水稻秸秆中半纤维素成分的减少，同时产生抑制酶解反应进行的副产物. 因此，2%的双氧水浓度是影响水稻秸秆酶解效率的临界点，使用浓度为2%的双氧水制备碱性双氧水预处理水稻秸秆效果最佳.

图5 不同双氧水浓度下碱性双氧水预处理水稻秸秆酶解后还原糖含量的变化Fig.5 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by alkaline hydrogen peroxide with different concentrations of hydrogen peroxide

2.2.3 碱性双氧水预处理时间的影响

在1.5%氢氧化钠和2%双氧水的溶液中，40 ℃的条件下水浴处理水稻秸秆，考察预处理时间对水稻秸秆酶解糖化效果的影响. 由图6可知，预处理时间由1 h增至5 h，水稻秸秆酶解后还原糖含量显著增加，由509.91 mg/g增至568.58 mg/g. 继续延长预处理时间，水稻秸秆酶解后还原糖含量差异不显著(P>0.05)，试验过程中发现，碱性双氧水与水稻秸秆反应初期，有大量泡沫产生，在3 h左右泡沫逐渐消失，由此可见，双氧水在预处理初期已充分反应，预处理时间延长对水稻秸秆酶解效率促进效果不明显，碱性双氧水预处理时间选用5 h较为适宜.

图6 不同预处理时间下碱性双氧水预处理水稻秸秆酶解后还原糖含量的变化Fig.6 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by alkaline hydrogen peroxide under different time condition

2.2.4 碱性双氧水预处理温度的影响

由图7可知，在1.5%氢氧化钠和2%双氧水的溶液中，水浴处理水稻秸秆5 h，水稻秸秆酶解后还原糖含量随着一定范围温度(20~50 ℃)的增加，得到显著提高(P<0.05)，还原糖含量由458.53 mg/g逐步提至575.85 mg/g，酶解产糖率较未预处理水稻秸秆(132.70 mg/g)提高了336.2%. 但是，当预处理温度超过50 ℃，酶解得到还原糖含量出现下降，双氧水稳定性较差，温度升高使得双氧水分解速率提高，碱性双氧水中有效成分降低，导致木质素脱除效果下降[30].所以，在温度为50 ℃条件下进行碱性双氧水预处理最为适宜.

图7 不同预处理温度下碱性双氧水预处理水稻秸秆酶解后还原糖含量的变化Fig.7 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by alkaline hydrogen peroxide under different temperature condition

2.3 扫描电镜分析

分别对未预处理、1.25%的氢氧化钠80 ℃处理3 h、碱性双氧水(1.5%的氢氧化钠+2%的双氧水) 50 ℃处理5 h的水稻秸秆进行电镜扫描分析，结果如图8所示. 在预处理前后水稻秸秆的表面形态结构发生了明显的变化，未预处理的水稻秸秆结构完整紧密，具有连续紧凑的纤维束，部分断裂是由于粉碎时的物理作用力导致. 比较氢氧化钠预处理水稻秸秆前后的电镜扫描图片后发现，氢氧化钠溶液会与水稻秸秆发生润胀作用，在氢氧化钠处理后水稻秸秆表面出现了较为明显的糊化现象，处理后的水稻秸秆变成许多碎裂的小块，水稻秸秆中木质素成分被溶出导致紧密的纤维束被破坏，氢氧化钠对水稻秸秆的润胀作用增加了纤维素的比表面积，提高了酶解糖化效率[31]. 比较碱性双氧水预处理水稻秸秆前后的电镜扫描图片后发现，在碱性双氧水处理后水稻秸秆表面出现了许多孔洞，且表面呈现更为明显的糊化现象，由此可见，双氧水促进了氢氧化钠对水稻秸秆的润胀作用，使得水稻秸秆变得更加松散，增大了水稻秸秆的比表面积，水稻秸秆表面出现的孔洞是由于双氧水对水稻秸秆中木质素与半纤维素的分解作用，使得水稻秸秆中的纤维素与木质素、半纤维素的链接被破坏，提高了纤维素酶对水稻秸秆的水解效率.

图8 预处理前后水稻秸秆的扫描电镜图片Fig.8 SEM images of rice straw before and after pretreatment

2.4 红外光谱分析

分别对未预处理、1.25%氢氧化钠80 ℃处理3 h、碱性双氧水(1.5%的氢氧化钠+2%的双氧水) 50 ℃处理5 h的水稻秸秆进行红外光谱分析，所得到的红外光谱如图9所示. 在红外光谱图中，898 cm−1处为纤维素β-糖苷键的特征峰[32]，经过氢氧化钠预处理和碱性双氧水预处理后的水稻秸秆，在该特征峰处强度增加，这是由于氢氧化钠和双氧水溶解了部分半纤维素与木质素，使得处理后的水稻秸秆纤维素含量增加. 1 515 cm−1处为木质素芳香族苯环骨架振动的特征峰，1 720 cm−1处的特征峰对应木质素中非共轭羰基的伸缩振动峰[33]，与未预处理水稻秸秆相比，这两个特征峰在经过氢氧化钠预处理或碱性双氧水预处理后强度明显减弱，可见氢氧化钠预处理和碱性双氧水预处理能够很好地消解水稻秸秆中的木质素成分.1 062、1 159、1 420与1 639 cm−1处均为纤维素的特征吸收峰，2 910和3 410 cm−1附近的吸收峰分别对应碳水化合物−OH和C−H的伸缩振动峰[34]，经过预处理后的水稻秸秆样品与未预处理的水稻秸秆样品相比，这几个特征峰的强度均有明显的增加，表明氢氧化钠预处理和碱性双氧水预处理均能在破坏纤维素结构的同时，能够较好保留纤维素和半纤维素等碳水化合物，提高酶解糖化效果.

图9 水稻秸秆预处理前后红外光谱图Fig.9 FTIR images of rice straw before and after pretreatment

2.5 X射线衍射光谱分析

分别对未预处理、1.25%氢氧化钠80 ℃处理3 h、碱性双氧水(1.5%的氢氧化钠+2%的双氧水)50 ℃处理5 h的水稻秸秆进行X射线衍射分析，所得到的X射线衍射图谱如图10所示. 纤维素是水稻秸秆最主要的部分，是以β-1,4糖苷键链接D-葡萄糖组成的天然链状高分子化合物，纤维素的结构有结晶结构和无定形结构，纤维素的结晶度表示纤维素结晶部分占纤维素整体的比例，反映了纤维素的结晶程度. 预处理前后的水稻秸秆在2θ=22°处有明显的衍射单峰，对应纤维素Ⅰ的(002)晶面，预处理后该衍射峰强度显著增强. 由表1可知，与未预处理的水稻秸秆相比，经过氢氧化钠预处理和碱性双氧水预处理的水稻秸秆结晶度有所升高，从21.54%分别升至28.95%和32.33%，这是由于氢氧化钠预处理和碱性双氧水预处理去除了水稻秸秆中的木质素和半纤维素成分，氢氧化钠的润胀作用会破坏纤维素的无定形结构，使得水稻秸秆的结晶度增加[35]. 相比氢氧化钠预处理，碱性双氧水预处理后的水稻秸秆结晶度变化更大，可见在碱性双氧水预处理中，双氧水能强化氢氧化钠的润胀效果，加强对水稻秸秆中木质素和半纤维素成分的分解能力[36]. 在26°处出现的尖锐衍射峰为半纤维素的衍射峰，水稻秸秆经氢氧化钠预处理和碱性双氧水预处理后，该衍射峰强度降低，说明氢氧化钠和碱性双氧水能够有效降解半纤维素，提高酶解糖化效率[37].

图10 水稻秸秆预处理前后XRD图谱Fig.10 XRD images of rice straw before and after pretreatment

表1 预处理前后水稻秸秆X射线衍射图谱分析Table 1 XRD analysis of rice straw before and after pretreatment

3 结论

a) 分别对氢氧化钠预处理和碱性双氧水预处理的条件进行优化，氢氧化钠预处理和碱性双氧水预处理都能较好地促进水稻秸秆的酶解糖化过程，得到较高的还原糖含量. 氢氧化钠预处理在使用浓度1.25%、时间3 h、温度80 ℃的条件下对水稻秸秆进行处理最优，酶解溶液中还原糖含量为480.81 mg/g，比未预处理水稻秸秆酶解液中还原糖含量(132.70 mg/g)提高了262.3%. 碱性双氧水预处理在使用氢氧化钠浓度为1.5%与双氧水浓度为2%的碱性双氧水、时间5 h、温度50 ℃的条件下对水稻秸秆进行处理最优，酶解溶液中还原糖含量为575.85 mg/g，比未预处理水稻秸秆酶解液中还原糖含量(132.70 mg/g)提高了336.2%.

b) 电镜扫描分析表明，氢氧化钠预处理与碱性双氧水预处理均能破坏水稻秸秆纤维之间的紧密结构，使水稻秸秆发生断裂，产生大量孔洞，同时表面出现了明显的糊化现象，增加了水稻秸秆的表面积，提高了纤维素酶的酶解产糖效率.

c) 红外光谱与X射线衍射分析表明，氢氧化钠和碱性双氧水均能较好地消解水稻秸秆中的木质素，并保留大量纤维素与半纤维素. 双氧水能够强化氢氧化钠对木质素的分解能力，相比氢氧化钠，碱性双氧水对水稻秸秆木质素成分的消解效果更好.