内循环比对反硝化除磷工艺处理效果和群落结构的影响

卢瑞朋，徐文江，李安峰*，董 娜，孙光溪

1. 北京市生态环境保护科学研究院，北京 100037

2. 国家环境保护工业废水污染控制工程技术（北京）中心，北京 100037

我国受纳水体富营养化问题日益加重[1-2]，污水中的氮磷排放需要进一步控制；同时，各地区污水处理厂的污水排放标准也日益严格[3]. 例如，北京市出台的DB11/ 890−2012《城镇污水处理厂水污染物排放标准》A标准中对于新建城镇污水处理厂排放的污水明确规定，化学需氧量(COD)、总氮(TN)、氨氮(NH4+-N)和总磷(TP)浓度的排放限值分别为20、10、1.0和0.2 mg/L. 为解决污水中氮磷带来的环境问题以及满足日益严格的排放标准，需要对氮磷进行有效去除. 目前，生活污水处理工艺多采用生物处理方法，如厌氧-缺氧-好氧(A2/O)工艺、缺氧-好氧(AO)工艺或多级缺氧-好氧(MAO)工艺. A2/O工艺是应用最为广泛的一种污水处理工艺，具有同步脱氮除磷能力，但其脱氮除磷效果有待进一步提高. MAO工艺具有高脱氮率且应用广泛，但缺少厌氧释磷单元，除磷能力有限[4].

与传统聚磷菌厌氧释磷和好氧吸磷的生物除磷过程不同，反硝化除磷(DPR)技术利用反硝化聚磷菌(DPAOs)在厌氧条件下释磷，随后在缺氧条件下将硝酸盐作为电子受体并进行吸磷过程，通过“一碳两用”的方式达到节省碳源、降低能耗的目的[5-10]. 南非开普敦大学开发的UCT工艺通过厌氧-缺氧内循环系统来强化厌氧和缺氧环境，实现DPAOs的富集[11]. 因此，UCT工艺作为新型可持续发展的反硝化除磷工艺受到广泛关注[11-12]. 许多研究者在UCT工艺的基础上，耦合分段进水MAO工艺(UCT-MAO)，提高了系统的脱氮除磷能力[13-17]. 但是若UCT工艺的内循环比过高，大量的硝酸盐会通过内循环系统从缺氧池进入厌氧池从而影响厌氧释磷过程，因此UCT工艺无法通过内循环系统对DPAOs进一步强化富集[18-19].

为进一步优化UCT工艺的反硝化除磷能力，笔者所在课题组前期基于反硝化除磷理论，借鉴UCT工艺特点，在分段进水MAO工艺首端增设厌氧池和缺氧池(反硝化除磷池)，调整内循环系统和污泥回流系统，为工艺提供反硝化除磷环境，开发了一种基于MAO工艺的新型反硝化除磷工艺(DPR-MAO工艺)[4,20]. DPR-MAO工艺的主要特点是在单独的反硝化除磷池中富集DPAOs，避免了过高的内循环比对反硝化除磷过程的影响. 因此，该研究在此基础上探讨通过调节内循环系统强化反硝化除磷的可行性，以及DPR-MAO工艺独特的内循环系统对脱氮除磷效能的影响，以期为DPR-MAO工艺的工程应用提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 试验装置及运行条件

DPR-MAO工艺反应器由有机玻璃制成，工艺流程图如图1所示，总有效容积为24 L，其中，厌氧池、反硝化除磷池、一级缺氧池和二级缺氧池均为3 L，一级好氧池和二级好氧池均为6 L. 工艺共设置两条内循环系统和一条污泥回流系统. 其中，两条内循环分别为AA内循环系统(由一级缺氧池回流到厌氧池)和AO内循环系统(由二级好氧池回流至反硝化除磷池). AA内循环系统可以强化厌氧-缺氧环境，从而富集DPAOs；AO内循环系统可以将好氧池的硝化液回流至反硝化除磷池，为反硝化除磷过程提供充足的电子受体(NO3−-N)，保证了脱氮除磷效果.DPR-MAO工艺反应器的运行方式为多段进水，进水分三段进入厌氧池(Q1)、一级缺氧池(Q2)和二级缺氧池(Q3)，分段进水配比为Q1∶Q2∶Q3=6∶7∶3. 试验过程中厌氧池溶解氧(DO)低于0.2 mg/L，反硝化除磷池和缺氧池DO浓度均低于0.5 mg/L，好氧池DO浓度在2~3 mg/L之间，温度在25 ℃左右，水力停留时间(HRT)为12 h，污泥回流比100%. 为保证污泥中功能微生物富集，工艺启动过程的适应期不排泥，稳定运行阶段污泥停留时间(SRT)保持在18 d,污泥(MLSS)浓度在3 000 mg/L左右. 工艺连续运行100 d，其中1~20 d为运行适应期，21~60 d为稳定期第一阶段(内循环比为100%)，61~100 d为稳定期第

图1 DPR-MAO工艺示意Fig.1 Schematic diagram of DPR-MAO process

二阶段(内循环比为200%)，各阶段进水水质如表1所示.

表1 原污水进水水质Table 1 Water quality of raw wastewater

1.2 接种污泥与污水水质

接种污泥取自某运行状况良好的城镇生活污水处理厂A2/O工艺的回流活性污泥. 实验室进水采用模拟废水，以乙酸钠和丙酸钠按4∶3 (质量比)作为碳源，以NH4Cl和KH2PO4作为氮磷营养物，投加MgCl2和CaCl2满足微生物对Ca2+、Mg2+的要求. 此外，投加微量元素营养液0.6 mg/L以满足微生物所需，营养液具体成分包括0.9 g/L FeCl3、0.15 g/L H3BO4、0.03 g/L CuSO4·5H2O、0.18 g/L KI、0.12 g/L ZnSO4·7H2O、0.05 g/L MnSO4、0.15 g/L CoCl2·7H2O、0.06 g/L NaMo2H2O[18,21].

1.3 氮磷质量平衡计算

为明确DPR-MAO工艺各反应池对系统脱氮除磷的贡献，对各反应池进行氮磷质量平衡计算，计算公式：

式中：Q代表进水总流量，L/h；Q1、Q2和Q3代表分段进水流量，L/h；Qr1代表AA内循环流量，L/h；Qr2代表AO内循环流量，L/h；QR代表污泥回流流量，L/h；SINF-N,P、SANA-N,P、SDPR-N,P、SAN1-N,P、SO1-N,P、SAN2-N,P、SO2-N,P和SEFF-N,P分别代表进水、厌氧池、反硝化除磷池、一级缺氧池、一级好氧池、二级缺氧池、二级好氧池和出水的NO3−-N或PO43−-P浓度，mg/L；∆ANA-N,P、∆DPR-N,P、∆AN1-N,P、∆O1-N,P、∆AN2-N,P和∆O2-N,P分别代表厌氧池、反硝化除磷池、一级缺氧池、一级好氧池、二级缺氧池和二级好氧池的NO3−-N或PO43−-P去除量，mg/h.

1.4 水质指标检测及分析方法

试验装置运行期间，每隔2 d检测一次水样.COD浓度的测定依据《水质 化学需氧量的测定 快速消解分光光度法》(HJ/T 399−2007)；TN浓度的测定依据《水质 总氮的测定 碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》(HJ 636−2012)；NH4+-N的测定依据《水质氨氮的测定 纳氏试剂分光光度法》(HJ 535−2009)；NO3−-N的测定依据《水质 硝酸盐氮的测定 紫外分光光度法》(HJ/T 346−2007)；TP和PO43−-P浓度的测定依据《水和废水监测分析方法》(第四版)中的钼锑抗光度法测定；MLSS的测定依据《水质 悬浮物的测定 重量法》(GB 11901−1989)；DO采用溶解氧仪(HACH，美国)测定.

1.5 高通量测序分析方法

1.5.1 样本收集

在DPR-MAO工艺反应器运行的第60天分别在各具有除磷功能的反应池(反硝化除磷池、一级好氧池和二级好氧池)取污泥样品，依次编号为M1、M2、M3、M4、M5、M6，其中，M1、M2和M3代表稳定期第一阶段反硝化除磷池、一级好氧池和二级好氧池的污泥样本，M4、M5、M6代表稳定期第二阶段反硝化除磷池、一级好氧池和二级好氧池的污泥样本.

1.5.2 DNA抽提、PCR扩增及Illumina Miseq测序

利用E.Z.N.A.®soil DNA kit (Omega Bio-tek, 美国)试剂盒进行微生物群落总DNA抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, 美国)测定DNA浓度和纯度；使用引物338F (ACTCCTACGGG AGGCAGCAG)和806R (GGACTACHVGGGTWTCT AAT)对16S rRNA基因V3~V4可变区进行PCR扩增. 利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)以及数据处理.

2 结果与讨论

2.1 有机物和营养物质去除效能分析

DPR-MAO工艺反应器运行的启动适应期(1~20 d)和稳定期(21~100 d)的进出水COD、TN、NH4+-N和TP浓度及其去除率如图2所示. 由图2(a)可见，稳定期第一阶段(21~60 d)和稳定期第二阶段(61~100 d)都实现了COD的高效去除，平均出水浓度分别为10.31和7.07 mg/L，平均去除率分别为96.92%和98.00%，满足DB11/ 890−2012一级A排放标准. 此外，内循环系统中AA内回流和AO内回流的回流比由稳定期第一阶段的100%提至第二阶段的200%后，COD的出水浓度并没有明显变化，说明内循环系统回流比的改变对有机物的去除效果影响不大.

图2 DPR-MAO工艺各阶段COD、TN、NH4+-N和TP的去除效果Fig.2 Removal performance of COD, TN, NH4+-N and TP in different operation stages of DPR-MAO process

由图2(b)(c)可见，稳定期两个阶段的NH4+-N平均出水浓度分别为0.41和0.34 mg/L，平均去除率分别为99.40%和99.52%，满足DB11/ 890−2012一级A排放标准. 结果表明，在两个运行阶段都实现了稳定的硝化过程. TN在稳定期第一阶段平均出水浓度为17.00 mg/L，接近于GB 18918−2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级A标准限值(15 mg/L)，高于DB11/ 890−2012一级A标准限值(10 mg/L). 当工艺提高了内循环系统回流比后，TN去除率由76.05%提至87.46%，平均出水浓度(9.04 mg/L)满足DB11/ 890−2012一级A标准要求.

由图2(d)可见，适应期TP的去除效果不稳定，稳定期第一阶段TP平均出水浓度为1.03 mg/L，平均去除率为86.39%. 当工艺提高了内循环比后，第二阶段TP平均出水浓度为0.49 mg/L，去除率为93.42%.可以看出，在第二阶段TP的去除效果最优. 但在稳定期TP出水浓度在部分时间点较高，如在第27天，TP出水浓度为2.14 mg/L，主要原因在于前期活性污泥培养过程中为保证功能菌的高效富集，排泥量较少，之后增加排泥量，TP出水浓度明显下降.

由表2可见：传统MAO工艺和前置厌氧区MAO工艺(A-MAO)的脱氮除磷效果并不理想，采用分段进水的三级AO的MAO工艺的脱氮率为75.4%[17]，而采用两级AO的A-MAO工艺脱氮率仅为39%[22]；UCT-MAO工艺的脱氮除磷效果较A-MAO工艺有明显提升；此外，相比于其他工艺，DPR-MAO工艺的同步脱氮除磷效果更好.

表2 MAO工艺的结构、参数和性能比较Table 2 Comparisons of configurations, operational parameters and performance of multistage anoxic-oxic process

2.2 脱氮除磷过程分析

为充分了解DPR-MAO工艺中氮磷营养物的去除过程，测定了NO3−-N和PO43−-P在不同反应池的浓度变化及其利用性能.

由图3(a)可见，一级好氧池(O1)和二级好氧池(O2)的NO3−-N浓度较高. 好氧池的硝化反应使得NO3−-N出现了负去除现象，这是由于好氧池中的NH4+-N 通过硝化反应生产了大量NO3−-N[15]. 而一级缺氧池和二级缺氧池去除了大量的NO3−-N〔见图4(a)〕，表明NO3−-N在缺氧池被反硝化菌通过反硝化反应去除[22]. 二级好氧池出水中的NO3−-N经AO内循环系统和污泥回流系统进入反硝化除磷池(DPR)被去除，此时NO3−-N浓度为7.62 mg/L(稳定期第一阶段)和3.68 mg/L(稳定期第二阶段)；随后，一级缺氧池(AN1)的反硝化菌通过反硝化反应去除剩余的NO3−-N，此时NO3−-N浓度降至0.94 mg/L(稳定期第一阶段)和0.52 mg/L(稳定期第二阶段). 另外，最前端的厌氧池NO3−-N浓度最低，两个阶段NO3−-N浓度分别为0.14 mg/L(稳定期第一阶段)和0.04 mg/L(稳定期第二阶段)，这主要是因为厌氧池不接纳回流污泥，并且因缺氧池进一步去除了剩余的NO3−-N，从而避免了NO3−-N进入厌氧池影响聚磷菌厌氧释磷过程.

由图3(b)可见，稳定期厌氧池PO43−-P浓度最高，且超过PO43−-P进水浓度. 这是由于在厌氧条件下聚磷菌的释磷作用所致〔见图4(b)〕. 混合液进入反硝化除磷池后，PO43−-P浓度降低，在稳定期第二阶段的运行条件下PO43−-P降低更为明显. 随后，一级好氧池和二级好氧池进一步通过好氧吸磷反应去除剩余的磷.在改良MAO工艺的案例中，在缺氧池和好氧池中也发现了同步除磷现象[16-17]，这表明在反硝化除磷池中有可能发生了缺氧吸磷现象. 对比稳定期第一阶段和稳定期第二阶段还可以发现，稳定期第一阶段在二级好氧池才出现明显的PO43−-P浓度降低，而在稳定期第二阶段中一级好氧池就可以实现PO43−-P浓度的明显降低，这表明在两种运行条件下DPR-MAO工艺的磷去除机理存在差异.

图3 DPR-MAO工艺各阶段各反应池NO3−-N和PO43−-P浓度的变化情况Fig.3 Variations of NO3−-N and PO43−-P concentration of each reaction tank of DPR-MAO process in different operation stages

为了进一步揭示DPR-MAO工艺氮磷去除过程以及不同内循环回流比对脱氮除磷效能的影响，对稳定期第一阶段和稳定期第二阶段各反应池的氮磷质量平衡进行计算，结果如图4所示. 由图4(a)可见，NO3−-N主要是由反硝化除磷池、一级缺氧池和二级缺氧池去除. 在反硝化除磷池的缺氧条件下，NO3−-N的去除量分别为16.49 mg/h (稳定期第一阶段)和14.19 mg/h (稳定期第二阶段)，而PO43−-P的去除量分别为−3.31mg/h (稳定期第一阶段)和21.33 mg/h (稳定期第二阶段). 这表明在反硝化除磷池中NO3−-N和PO43−-P的去除在稳定期第二阶段同时发生，与Ge等[17]研究结果相似. 研究[13-14,16-17]表明，在缺氧条件下，DPAOs利用了NO3−-N作为反硝化除磷的电子受体发生了缺氧吸磷现象. 稳定期第一阶段，反硝化除磷池的PO43−-P没有去除，PO43−-P去除量反而增加了3.31 mg/h，表明稳定期第一阶段反硝化除磷池缺氧吸磷能力较弱，主要依靠好氧池传统聚磷菌的好氧吸磷作用. 稳定期第二阶段，厌氧池PO43−-P的产生量为31.76 mg/h，远大于稳定期第一阶段(6.73 mg/h)，表明稳定期第二阶段厌氧池释磷更加充分；同时，稳定期第二阶段的除磷过程则是以缺氧池的反硝化除磷(去除量为21.33 mg/h)和一级好氧除磷(去除量为19.83 mg/h)为主，表明在稳定期第二阶段除磷反应主要发生在反硝化除磷池和两级好氧池，并且反硝化除磷池的除磷能力最好. 因此，回流比的提高可以强化反硝化除磷池的除磷效果，而脱氮过程不受影响.

图4 DPR-MAO工艺各阶段各反应池NO3−-N和PO43−-P质量平衡Fig.4 Mass balance of NO3−-N and PO43−-P of each reaction tank of DPR-MAO process in different operation stages

2.3 微生物群落分析

2.3.1 微生物群落丰富度和生物多样性

该研究6组污泥样品(M1~M6)的微生物群落丰富度和多样性指数如表3所示. 由表3可见，6个样本的覆盖率均大于99.5%，表明此次高通量测序的结果足以代表样本中微生物的真实情况.

表3 微生物菌群的丰富度和多样性指数Table 3 Species richness and diversity indicators of microbial community

Sobs指数、Ace指数和Chao指数反映了微生物群落的丰富度，其数值越高代表微生物群落越丰富，Shannon-Wiener指数和Simpson指数反映了微生物群落的多样性，Shannon-Wiener指数越高代表微生物群落多样性越高，Simpson指数则相反[23-25]. 由表3可见，反硝化除磷池的微生物种群最丰富，微生物多样性也最高. 对比两个阶段反硝化除磷池的微生物多样性和丰富度指数可以发现，稳定期第二阶段反硝化除磷池的微生物种群较丰富，但多样性较低，表明稳定期第二阶段反硝化除磷池功能微生物逐渐占主导地位，微生物群落多样性下降.

2.3.2 微生物群落组成分析

污泥样品中微生物在门水平的种群组成如图5所示. 由图5可见，变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)为优势菌门，二者的总相对丰度为83.04%~92.77%，Proteobacteria的相对丰度为35.94%~75.50%，Bacteroidota的相对丰度为17.27%~49.37%. 对于具有除磷功能的反应池(反硝化除磷池、一级好氧池和二级好氧池)来说，稳定期第一阶段Proteobacteria和Bacteroidota的相对丰度接近，分别为35.94%~38.79%和46.86%~49.37%；当提高工艺的内循环比时，Proteobacteria成为最主要的优势菌门，相对丰度为67.67%~75.50%，远高于Bacteroidota. 目前，多项研究[26-29]表明，多数具有脱氮和反硝化除磷功能的微生物都来自Proteobacteria.

图5 DPR-MAO工艺各反应池微生物门水平组成Fig.5 Composition of microorganisms at the phylum level in each reaction tank of DPR-MAO process

为进一步阐明工艺系统中具有除磷功能反应池(反硝化除磷池、一级好氧池和二级好氧池)的相关功能微生物群落组成，在属分类学水平上选取丰度较高的Proteobacteria进行分析. 由图6可见，Proteobacteria中具有反硝化除磷功能的菌属主要有Thiothrix、Dokdonella、Candidatus accumulibacter、Thauera、Comamonas、Dechloromonas和Pseudomonas[30-37].

图6 DPR-MAO工艺各反应池微生物属水平组成Fig.6 Composition of microorganisms of at the genus level in each reaction tank of DPR-MAO process

由表4可见，稳定期第二阶段反硝化除磷功能菌属的相对丰度为56.08%~60.36%，远高于稳定期第一阶段(10.92%~11.79%). 另外，稳定期第一阶段反硝化除磷功能菌属相对丰度最高的是Dokdonella(4.44%~5.23%)，稳定期第二阶段相对丰度最高的是Thiothrix(53.58%~56.64%)，表明内循环比的增大强化了DPAOs在微生物群落中的优势地位.

表4 DPR-MAO工艺各反应池功能微生物相对丰度变化Table 4 Changes in the relative abundance of functional microorganisms in each reaction tank of DPR-MAO process

3 结论

a)当DPR-MAO工艺的内循环比为200%时，COD、TN、NH4+-N和TP的平均去除率分别为98.00%、87.46%、99.52%和93.42%，平均出水浓度均可达到GB 18918−2002一级A标准，其中COD、TN和NH4+-N的平均出水浓度满足北京市DB11/ 890−2012中的一级A排放标准.

b) 反硝化脱氮过程主要发生在反硝化除磷池和各级缺氧池；除磷过程主要通过厌氧池的厌氧释磷、反硝化除磷池的缺氧吸磷以及各级好氧池的好氧吸磷反应进行. 调节内循环比可以提高反硝化除磷池的缺氧吸磷能力，从而强化DPR-MAO工艺的反硝化除磷性能.

c)高通量测序结果表明，反硝化除磷池、一级好氧池和二级好氧池中的微生物以Proteobacteria和Bacteroidota为主，二者相对丰度在83.04%~92.77%之间. 具有反硝化除磷功能的菌属主要有Thiothrix、Dokdonella、Candidatus accumulibacter、Thauera、Comamonas、Dechloromonas和Pseudomonas. 内循环比的提高强化了DPAOs在微生物群落中的优势地位.