一株高产β-苯乙醇酵母的筛选、鉴定及其增殖培养条件优化

刘子睦，李娜，项馨瑶，薛鲜丽，2，王德培，3*

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457；3.天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津 300457）

β-苯乙醇（2-phenylethanol，2-PE），又名 2-苯乙醇。常温下为无色、透明液体，具有令人愉悦的玫瑰香味[1]，属于高级芳香醇，易溶于醇、酯、苯和醛等有机溶剂中。天然的β-苯乙醇主要存在于显花植物的茎、叶及其提取的精油中，如玫瑰、茉莉、风信子等[2]。β-苯乙醇及其衍生酯（乙酸苯乙酯、丙酸-2-苯乙酯等）是重要的芳香物质，可作为食品添加剂，广泛应用于食品和日化用品等生产领域[3]。而且以β-苯乙醇为底物合成的苯乙醇苷具有抗肿瘤、强心等作用，故在医疗领域有着重要应用[4-6]。近期有研究发现，β-苯乙醇的混合辛烷值质量高于现在使用的许多辛烷值促进剂，所以认为β-苯乙醇是一种理想的辛烷值促进剂[7]。

当前市场上的β-苯乙醇主要通过化学合成，化学合成过程中会产生多种杂质，使得无法达到食用及香料的质量标准[8-9]。通过植物萃取得到的β-苯乙醇安全无害，但植物所含β-苯乙醇浓度非常低，且提取生产周期长、成本昂贵[10]，远远不能满足市场需求。微生物合成β-苯乙醇是欧洲食品管理局认可的“天然”方法[11]，是合成天然β-苯乙醇工业化新趋势。

自然界中存在能够合成β-苯乙醇的多种微生物。牛明福等[12]筛选得到一株马克斯克鲁维酵母，其β-苯乙醇产量可达到1.45 g/L。富志磊等[13]从酒曲中筛选得到一株耐高温季也蒙毕赤酵母合成β-苯乙醇浓度为1.66 g/L。但微生物合成β-苯乙醇受到产物抑制，3 g/L的β-苯乙醇可以抑制大部分的微生物生长，是微生物发酵法合成β-苯乙醇的瓶颈[14]。

本研究从玉米胚芽粕和玉米皮、玉米淀粉渣等淀粉加工下脚料，及其废料堆放的土壤中取样筛选到一株可耐受高浓度β-苯乙醇的酵母菌株，通过优化其增殖培养条件获得大量菌体以实现β-苯乙醇转化发酵。为后期的研究与生产β-苯乙醇奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

玉米胚芽粕、玉米皮、玉米淀粉渣、土壤样品：黑龙江金象生化有限责任公司。

1.1.2 试剂

葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化锰、硫酸铜（均为分析纯）：天津市北方天医试剂公司；β-苯乙醇（色谱纯）、L-苯丙氨酸（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.3 培养基

酵母提取物蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基[15]：葡萄糖 20g/L、酵母粉 10 g/L、胰蛋白胨20 g/L。灭菌条件：115℃、20 min。

初筛培养基：葡萄糖10 g/L、酵母粉10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、琼脂20 g/L。灭菌条件：115℃、20 min。灭菌后加入终浓度达到2 g/L的β-苯乙醇。

复筛培养基：葡萄糖10 g/L、酵母粉10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、琼脂20 g/L。灭菌条件：115℃、20 min。灭菌后加入终浓度达到3.5 g/L的β-苯乙醇。

发酵培养基[13]：葡萄糖80 g/L、酵母粉5.5 g/L、磷酸二氢钾5 g/L、硫酸镁0.5 g/L。灭菌条件：115℃、20 min。灭菌后加入8 g/L的L-苯丙氨酸。

1.2 仪器与设备

752紫外可见分光光度计：天津市华伟科技有限公司；LRH-250-A生化培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；AELTA320 pH计：梅特勒仪器（上海）有限公司；HYG恒温培养振荡器：上海欣蕊自动化设备有限公司；LDZX-50FB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌分离

分别称取10 g的玉米胚芽粕和玉米皮、玉米淀粉渣、土壤样品放入装有100mL含2g/Lβ-苯乙醇无菌蒸馏水的锥形瓶（250mL）中，在180r/min，28℃的条件下，振荡培养2 h。取样品悬液，采用10倍梯度稀释法[16]，从104、105稀释倍数的菌液中吸取100 μL涂布在含有2 g/L β-苯乙醇的YEPD固体平板上（每个稀释度涂两个平板）。将涂布后的平板放在28℃的恒温培养箱中培养20 h。

将实验室现存的23株酵母菌分别在YEPD平板上活化，挑取单菌落于液体YEPD培养基中，在180r/min，28℃的条件下，振荡培养20 h。采用10倍梯度稀释法[16]，从 106、107稀释倍数的菌液中吸取 100 μL 涂布在含有2 g/L β-苯乙醇的YEPD固体平板上（每个稀释度涂两个平板）。将涂布后的平板放在28℃的恒温培养箱中培养20 h。将初筛中生长快、菌落直径大的进行复筛，复筛将β-苯乙醇浓度提高到3.5 g/L，从中选择长势较好的菌株进行进一步分离纯化。

1.3.2 酵母菌筛选

采用三区划线的方法，将纯化好的酵母菌株接种于含有4 g/L β-苯乙醇的YEPD固体平板上，在28℃的恒温培养箱中培养60 h。每12 h观察1次生长状况，挑选长势较好的菌株（YDF-1）进行保存。

1.3.3 酵母菌形态观察及分子鉴定

菌落及细胞形态观察：将筛选得到的酵母接种到YEPD平板上，在28℃条件下培养20 h，观察其菌落形态[17]；挑取平板上菌落直径较大的单菌落到YEPD液体培养基中，在28℃、180 r/min的条件下摇床振荡培养20 h，在光学显微镜下观察YDF-1菌落形态。

YDF-1的分子鉴定：18S rDNA序列的聚合酶链式反应扩增采用真菌通用引物为NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和 NS8（5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′）[18]，扩增条件为 95℃ 5min，95℃ 30s，58℃ 30s，72 ℃ 90 s，30个循环，72℃，10 min。

1.3.4 β-苯乙醇标准曲线的绘制

取分析纯级别的β-苯乙醇试剂，配制浓度为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 g/L的标准品。采用高效液相色谱仪测定不同浓度标准品对应峰面积，并根据出峰面积绘制β-苯乙醇的标准曲线。

1.3.5 发酵液中β-苯乙醇含量的测定

取2mL发酵液，在8000r/min离心10min；取1mL上清液，用超纯水稀释10倍；用0.22 μm有机系滤膜过滤稀释后的发酵上清液。高效液相色谱条件：C-18反相柱 4.6 mm×250 mm×5 μm； 流动相为甲醇∶水=1∶1（体积比），流速 1 mL/min；检测波长260 nm；柱温30 ℃；进样量 10 μL。

1.3.6 增殖培养基优化

通过单因素试验确定合适的碳源、氮源，然后通过正交试验确定对应的碳源、氮源与磷酸氢二钾的浓度。在此基础上通过单因素试验确定合适的金属离子的种类与浓度，利用Design-Expert软件设计Box-Benhenken试验[19]并对试验结果进行分析。

通过比较YDF-1在YEPD培养基中的生长曲线和优化后的培养基中的生长曲线，评价优化后的培养基[20]。

1.3.7 酵母转化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇

以1.3.6中优化好的增殖培养基培养YDF-1，取40 mL发酵液，5 000 r/min离心15 min，收集菌体，转接于转化培养基中，培养48 h后，测得发酵液中β-苯乙醇含量。

1.3.8 酵母增殖菌体量的测定方法

比浊法：将发酵液稀释一定倍数，在600 nm波长下测定OD值[21]。

稀释微量活菌计数法：取100 μL菌液在1.5 mL离心管中进行梯度稀释,最后将10 μL稀释菌液点在平板上计数[22]。

1.4 数据分析

菌株测序结果通过Biodiet软件处理后，在NCBI核酸系列数据库中通过BLAST进行同源序列比对，再通过MEGA 7.0软件进行系统分析并构建系统发育树；通过IBM SPSS Statistics 25软件对碳源、氮源及金属盐离子单因素试验进行显著性分析；通过Design-Expert软件进行金属盐离子响应面试验设计和分析。

2 结果与分析

2.1 酵母菌株的分离鉴定

2.1.1 酵母菌分离

经过浓度为2.0 g/L β-苯乙醇的固体培养基初筛获得24株酵母菌，经3.5 g/L β-苯乙醇的固体培养基复筛得到6株菌。分别为实验室已有的Y322、Y714、YZM-1、RY7、RY3，以及从玉米胚原料中得到的酵母菌株YDF-1。

2.1.2 酵母菌筛选

60 h内，在4 g/L的β-苯乙醇的固体培养基上，只有YDF-1可以较好地生长。对YDF-1酵母菌株进行3轮分离纯化，甘油管保藏。再进行分子生物学鉴定。

2.2 YDF-1形态学及分子鉴定

2.2.1 YDF-1形态学鉴定

YDF-1单菌落形态如图1所示，YDF-1光学显微镜下形态如图2所示。

图1 YDF-1单菌落形态Fig.1 Single colony morphology of YDF-1

图2 YDF-1光学显微镜下形态Fig.2 Morphology of YDF-1 under light microscope

由图2可知，YDF-1在YEPD平板上28℃下培养24 h，菌落呈现圆形，初期边缘整齐，72 h开始，边缘有向外的假菌丝生成，菌落中间微微隆起，不透明呈乳白色。在YEPD液体培养基中28℃、180 r/min条件下培养20 h后，具有甜苹果香味。在光学显微镜下观察到的细胞形态：呈椭圆形或棒状，一端或两端芽殖。

2.2.2 YDF-1分子鉴定

YDF-1与相关菌株的18S rDNA进化树见图3。

图3 YDF-1与相关菌株的18S rDNA进化树Fig.3 18S rDNA evolutionary tree of YDF-1 and related strains

YDF-1测序得到的序列全长约为1 600 bp，通过BioEdit软件处理后，在NCBI核酸系列数据库中通过BLAST进行同源序列比对，下载相似性较高的酵母菌的相关序列。通过MEGA 7.0软件进行系统分析并构建系统发育树[23]。从进化树结果中可得出，YDF-1属于Pichia（毕赤酵母属），与Pichia kudriavzevii NRRL Y-5396（NG 063274.1）最为接近，相似性为99.88% 。

2.3 β-苯乙醇产量的测定

2.3.1 β-苯乙醇标准品的测定

β-苯乙醇浓度为0.5g/L标准品的高效液相色谱图如图4所示，β-苯乙醇出峰时间为8.087 min。

图4 0.5 g/L β-苯乙醇标准样品液相色谱图Fig.4 Liquid chromatography of 0.5 g/L β-phenylethanol standard sample

2.3.2 β-苯乙醇标准曲线的制备

以β-苯乙醇浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标绘制标准曲线结果见图5。

图5 β-苯乙醇标准品标准曲线Fig.5 β-Phenylethanol standard curve

由图5中标准曲线得到方程：A=1 428.3×C+5.61，R2为 0.999 04。

2.3.3 YDF-1发酵产β-苯乙醇的测定

YDF-1发酵60 h后发酵液的色谱图见图6。

图6 60 h发酵液液相色谱图Fig.6 60 h liquid chromatogram of fermentation broth

由图6可知，β-苯乙醇峰面积为409.2，将峰面积代入标准曲线中计算得苯乙醇浓度为2.83 g/L。说明YDF-1具有良好的发酵β-苯乙醇的潜力。

2.4 培养基及培养条件优化

2.4.1 碳源种类及浓度优化

碳源种类单因素结果见图7。选取20 g/L～100 g/L碳源初始浓度，培养YDF-1，观察其对YDF-1的增殖影响，结果见图8。

图7 不同碳源种类发酵液最终OD600值Fig.7 Final OD600value of fermentation broth of different carbon source species

图8 不同葡萄糖浓度的最终发酵液OD600值Fig.8 OD600value of final fermentation broth with different glucose concentration

由图7可知，6种碳源中果糖最合适YDF-1的生长，但葡萄糖作为自然界中分布最广泛的单糖，在实际生产中较果糖成本低，且发酵后活菌数相差不显著（P＞0.05），故选择葡萄糖作为碳源。由图8可知，菌体浓度随葡萄糖浓度的增大而增大，而且葡萄糖浓度（80 g/L～100 g/L）较高时 YDF-1增殖效果不显著（P＞0.05），因此选择葡萄糖的最佳浓度为100 g/L。

2.4.2 氮源种类及浓度优化

氮源种类单因素试验结果见图9。

图9 氮源种类与浓度单因素试验结果Fig.9 Results of single factor experiments on nitrogen source species and concentration

由图9可知，YDF-1对牛肉膏、胰蛋白胨和玉米浆的利用较好，当胰蛋白胨浓度为2 g/L时，可获得最高的菌体量，所以选择2 g/L的胰蛋白胨浓度作为最佳氮源。

2.4.3 碳源氮源与磷酸氢二钾的正交试验

根据单因素试验结果，YDF-1在葡萄糖浓度为100 g/L时可获得较高菌体量，且增幅较为平缓，所以选取80、100、120 g/L作为碳源水平选择。YDF-1在胰蛋白胨浓度为2 g/L时可获得较高菌体量，但增幅较大，所以选取2.0、2.5、3.0 g/L作为氮源水平选择。因为磷酸二氢钾在培养基中具有促进微生物生长繁殖的作用，且与葡萄糖和胰蛋白胨具有交互作用，所以选择磷酸氢二钾浓度作为第3个影响因子。选择葡萄糖浓度（A）、胰蛋白胨浓度（B）、磷酸二氢钾浓度（C）作为研究对象，设计三因素三水平正交试验，因素水平设计见表1，试验结果见表2。

表1 正交试验设计因素水平Table 1 Factor and levels of orthogonal experimental design

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

从表2可看出，胰蛋白胨浓度的改变对YDF-1菌体增殖的影响最大，葡萄糖浓度次之，磷酸氢二钾浓度对毕赤酵母YDF-1菌体增殖的影响最小。根据表2的结果得最佳组合为A1B3C2，即葡萄糖浓度100 g/L、胰蛋白胨浓度3.0 g/L、磷酸二氢钾浓度4.0 g/L。以A1B3C2的组合与正交组合中OD600值最高组（A3B3C2）组进行验证比较。经验证，A1B3C2组合的发酵液稀释35倍测得OD600值为0.753，A3B3C2组合的发酵液稀释35倍测得OD600值为0.732。故选择最佳组合为葡萄糖浓度为100 g/L、胰蛋白胨浓度为3.0 g/L、磷酸二氢钾浓度为4.0 g/L。

2.4.4 金属离子种类及浓度的优化

金属离子单因素试验结果见图10。

图10 不同金属离子种类的单因素试验结果Fig.10 Single factor experimental results of different metal ion types

由图10可知，与空白组相比，只有氯化锰、硫酸铜、硫酸镁对菌体增殖有显著促进（P＜0.05），硫酸铵、硫酸亚铁、硝酸钠、氯化钙对菌体增殖无显著性影响，而硫酸锌可能对YDF-1生长有抑制作用。通过SPSS软件分析，氯化锰、硫酸铜、硫酸镁3种金属离子均为显著影响因子，选择此3种进行后续的优化试验。

3种金属离子不同浓度单因素试验结果见图11。

图11 不同金属离子浓度的单因素试验结果Fig.11 Single factor experimental results for different metal ion concentrations

从图11中可看出酵母菌体量随硫酸镁与硫酸铜浓度增加先升高后下降，而添加氯化锰组的OD600值一直随着金属离子浓度的升高而降低。

根据上述的试验结果，利用Design-Expert软件设计三因素三水平的Box-Behnken试验，试验设计及结果见表3与表4。

表3 Box-Behnken试验设计水平及因素Table 3 Factor and levels of Box-Behnken experimental design

表4 Box-Behnken试验结果Table 4 Box-Behnken experimental results

通过Design-Expert软件对试验数据进行多元回归分析，可得到三元二次回归拟合方程：OD600=0.734585+0.202 422A+0.593 750B+0.505 625C+0.281 25AC-0.209 766A2-1.191 67B2-2.69375C2。

表5为YDF-1金属离子优化试验结果的回归系数显著性检验。

表5 回归系数显著性检验Table 5 Test for significance of regression coefficients

从表5中可看出：所选用的模型极显著（P=0.0002＜0.01），说明模型选择合适，且经方差分析结果表明，该方程的决定系数为R2=0.969 4，校正决定系数AdjR2=0.929 9，说明该模型预测值与实测值拟合度较高，能解释92.99% 的响应值的变化，因此可用此回归方程对试验结果进行分析预测。方程中一次项中A对结果影响显著，C对结果有极显著影响；二次项A2、B2、C2对结果均具有极显著影响；交互项中只有AC对结果有显著影响。

3个因子交互作用对OD600影响的响应曲图见图12。

图12 硫酸镁、硫酸铜和氯化锰浓度交互作用对OD600值的影响Fig.12 Effects of interaction levels of magnesium sulfate，copper sulfate and manganese chloride on OD600value

由图12可知，通过二次多项数学模型解逆矩阵，得出最佳金属离子浓度为硫酸镁0.5 g/L、硫酸铜0.25 g/L、氯化锰0.142 g/L,其预测YDF-1发酵液稀释35倍可获得最大OD600值为0.89。经后续两次验证，YDF-1发酵液稀释35倍测得OD600值分别为0.885与0.887，与预测值接近，所以可使用0.5 g/L的硫酸镁、0.25 g/L的硫酸铜、0.142 g/L的氯化锰作为金属离子最佳浓度。

2.5 生长曲线的测定

YDF-1的生长曲线见图13。

图13 YDF-1的生长曲线Fig.13 Growth curve of YDF-1

由图13可知，YDF-1在普通YEPD培养基中，0～2 h为延滞期，2 h～6 h为对数生长期，6 h以后为稳定期，此时发酵液中活菌数为5.3×108CFU/ml。YDF-1在优化培养基中，0～2 h为生长延滞期，2 h～13 h为生长对数期，13 h以后为稳定期，在20 h时取样，进行稀释涂布活菌计数，此时发酵液中活菌数为1.39×109CFU/mL。相比较YEPD培养基，优化后OD600值（稀释40倍）提高了2.4倍，活菌数提高了2.6倍。

2.6 增殖YDF-1转化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇

将YDF-1在上述增殖培养基中培养至OD600（稀释35倍）值高于0.85以上时，离心收集菌体，将菌体置于转化培养基中培养48 h，测其发酵液中β-苯乙醇浓度，结果见图14。

图14 48 h发酵液液相色谱图Fig.14 48 h liquid chromatogram of fermentation broth

由图14可知，β-苯乙醇对应峰面积为478.7，计算得到苯乙醇浓度为3.27 g/L。说明经增殖培养后再进行L-苯丙氨酸转化，可以有效地提高β-苯乙醇的产量。

3 结论

自然界中多种酵母都可以通过艾氏途径转化L-苯丙氨酸合成β-苯乙醇，但高浓度的β-苯乙醇会抑制酵母的生长，同时也有研究发现酵母对β-苯乙醇的耐受性越好，其转化合成β-苯乙醇的能力越强。所以选育可耐受高浓度β-苯乙醇的酵母是高产β-苯乙醇的必备条件之一。而本试验通过增殖培养实现了β-苯乙醇产量的增加，相比较传统方法，这种方法在缩短了发酵周期的同时也提高了β-苯乙醇产量，为后续转化合成β-苯乙醇的研究奠定了基础，为应用生产天然β-苯乙醇提供了菌株来源。

本文从玉米胚芽、玉米皮等淀粉生产下脚料中分离出的酵母菌株YDF-1，通过形态、18S rDNA序列分析鉴定，确认其为Pichia kudriavzevii（库德里阿兹威毕赤酵母）。经试验证明，YDF-1可耐受4 g/L的苯乙醇浓度，初步发酵β-苯乙醇产量为2.82 g/L，具有高产β-苯乙醇的潜力。通过单因素和响应面试验获得YDF-1增殖培养最优化培养基：葡萄糖100 g/L、胰蛋白胨 3 g/L、KH2PO44 g/L、MgSO4·5H2O 0.5 g/L、CuSO40.25 g/L、MnCl20.142 g/L。培养20 h，每毫升发酵液中含有活菌1.39×109个。相比初始YEPD培养基，活菌数提高了2.6倍。以此优化条件增殖培养YDF-1后进行初步转化试验生产β-苯乙醇，培养48 h时β-苯乙醇产量可达3.27 g/L。