热反硝化地芽孢杆菌水解催化剩余污泥提取蛋白质

丁雅婷,钟为章*,秦 学,宁志芳,李 月,陈赛男

热反硝化地芽孢杆菌水解催化剩余污泥提取蛋白质

丁雅婷1,2,钟为章1,2*,秦 学1,2,宁志芳1,2,李 月1,2,陈赛男1,2

(1.河北科技大学环境科学与工程学院,河北 石家庄 050018；2.河北省污染防治生物技术实验室,河北 石家庄 050018)

为实现剩余污泥无害化处理以及资源化利用,采用从高温堆肥基质中筛选出的可产蛋白酶、淀粉酶等胞外酶的嗜热菌—热反硝化地芽孢杆菌对污泥氮源进行提取,分析反应时间、污泥含固率以及嗜热菌粗酶液接种量对蛋白质提取的影响,并确定最佳反应条件.结果表明:水解过程中各因素对蛋白质回收率作用大小为:接种量>时间>含固率,得出最优工艺条件为:pH=7、=60℃、=8h、污泥含固率为4%以及嗜热菌接种量为20%,在此条件下污泥蛋白质提取率达到32.05%,氨基酸含量为359.6mg/L,多肽含量为1060.1mg/L,且污泥上清液粒径随着反应的进行逐渐减小.

嗜热菌；水解；剩余污泥；蛋白质；影响因素

2019年,我国剩余污泥年产量达到了6000万t,预计到2025年,剩余污泥年产量将达到9000万t[1].随着剩余污泥产量提高,传统的处理方法可持续性较差[2],已经不能满足日益增长的处理需求[3].与此同时,剩余污泥干重的30%～60%都是未被利用的蛋白质,这部分蛋白质经资源化处理可作为发泡剂和动物饲料的原料[4],从源头控制污泥减量化以及实现污泥资源化.

目前通过污泥水解实现污泥资源化和减量化的方法众多,主要为物理法[5]、化学法[6]、生物法[7].物化法处理剩余污泥经过多年发展,工艺已较为成熟,但成本高、副产物多等缺点限制了推广[8].生物法处理剩余污泥作为一种新型的方法,具有反应温和、副产物少、成本低等优点[9],且通过生物法处理剩余污泥可将污泥中剩余的部分蛋白质提取出用以制备饲料及有机肥[10]等衍生产品,真正实现了污泥资源化利用.生物预处理方法主要包括投加生物酶[11]和投加生物菌,由于直接投加生物酶时酶制剂成本较高,而筛选可分泌蛋白酶、淀粉酶等胞外酶的生物菌,可降低试验成本.

剩余污泥中存有少量的抗生素[12],其能与核糖核蛋白结合,抑制微生物蛋白质合成,阻碍嗜热菌在污泥中的增殖,从而影响产酶效果.Chen等[13]验证了抗生素会影响微生物群落的多样性和丰富度.因此为避免抗生素对嗜热菌产酶的影响,实现剩余污泥的高效降解,本研究通过将嗜热菌胞外酶进行提取后作用于剩余污泥,探究提取污泥氮源效果,分析其对污泥水解指标蛋白质、氨基酸、多肽含量以及粒径的影响,并通过响应面分析法优化其提取条件.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 污泥理化性质 试验污泥取自石家庄市某污水处理厂(A2/O)剩余污泥泵房,污泥取回后,静置沉淀,弃去上清液,降低污泥含水率.处理后的污泥性质如表1.将剩余污泥样品在4℃下贮藏,待用.

表1 剩余污泥基本理化性质

1.1.2 污泥群落结构 对剩余污泥进行16S V3- V4扩增区域的微生物分类测序,采用宏基因组技术解析剩余活性污泥的微生物群落结构.结果表明:从门水平而言,剩余污泥中优势微生物为变形菌门(28.32%)、拟杆菌门(16.39%)以及绿菌门(13.04%),3个优势菌门均属于革兰氏阴性菌.在剩余污泥中革兰氏阴性菌比例可达57.75%.微生物分类测序结果如图1所示.

图1 污泥微生物群落相对丰度

1.2 热反硝化地芽孢杆菌

嗜热溶胞菌是由本实验室从牛粪与秸秆的混合堆肥基质[14]中分离出的热反硝化地芽孢杆菌(DC8),保藏于中国普通微生物保藏中心,保藏号为CGMCC NO.23318.热反硝化地芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧菌,菌株形态呈细杆状,产芽孢,最适生长温度60℃,最佳pH值为7,最佳生长时间为24h,在生长过程中,热反硝化地芽孢杆菌可分泌蛋白酶、淀粉酶等多种胞外酶.由图1可知,污泥中革兰氏阴性菌占比较大,且革兰氏阴性菌细胞壁中蛋白质含量为60%,因此利用可产蛋白酶的嗜热菌进行溶胞有更好的处理效果.

1.3 实验方法

原代嗜热菌菌株DC8于4℃下保存,复壮过程如下:挑取原代嗜热菌接种于固体培养基,60℃下培养24h,选取在显微镜下菌体形态均匀的培养基,然后将其接种于250mL液体培养基中,60℃下培养24h,使其在波长600nm处吸光度达1.0,得到嗜热菌菌悬液.

将活化后的嗜热菌接种至液体培养基,调整不同时间(12,18,24,30和36h)、不同pH值(5.00,6.00,7.00,8.00和9.00)、不同温度(45,50,55,60和65℃),之后测定嗜热菌分泌蛋白酶和淀粉酶活性.为保证嗜热菌胞外酶可产生最佳水解效果,将最佳条件下的菌悬液于高速离心机(8000r/min)离心后得到嗜热菌粗酶液,作为接种体接种于剩余污泥中.

首先利用氢氧化钠或盐酸来调节剩余污泥pH值,之后将剩余污泥与嗜热菌粗酶液在反应器中混合,控制剩余污泥含固率、粗酶液投加量以及反应时间,实验过程利用恒温培养箱以60℃,120r/min进行振荡培养,保障酶催化剩余污泥所需的温度条件.待反应结束后,将处理后的剩余污泥用高速离心机(8000r/min)离心15min,收集上清液测定蛋白质、氨基酸、多肽含量以及粒径.

根据单因素试验结果,采用响应曲面分析法,以蛋白质提取率为响应值(),研究反应时间()、污泥含固率()以及嗜热菌接种量()对响应值()的影响,每个因素取3个水平,设计了三因素三水平的响应面优化实验.

1.4 分析方法

污泥pH值、COD、TSS、VSS、TS以及VS[15-16]采用标准方法测定;采用凯氏定氮法[17]测定蛋白质含量;氨基酸采用茚三酮比色法[18];多肽和蛋白酶酶活采用Folin酚法[19];淀粉酶活性采用3,5-二硝基水杨酸比色法[20];粒径分布采用全自动计数粒度仪(美国,LE400-05);污泥形貌采用环境扫描电子显微镜(QUANTA200)观察,倍数选择1000倍.试验过程中,每个样品进行3次平行检测,结果取平均值.

2 结果与讨论

2.1 嗜热菌产酶最佳生长条件

不同时间、pH值和温度下热反硝化地芽孢杆菌产蛋3白酶和淀粉酶活性影响如图2所示.

由图2a可知,在30h时,蛋白酶酶活达到最高值284.01U/mL,淀粉酶为137.38U/mL;在24h时,淀粉酶酶活达到最高值155.51U/mL,而蛋白酶达到278.36U/mL,综合考虑,24h是最佳反应时间.在酶活性中心存在一些处于电离状态的氨基酸残基[21],pH值不但会影响酶的稳定性,还会改变酶与底物的带电状态,在适宜pH值环境下,酶保持良好的稳定性,酶与底物的结合处于最适电离状态,有助于催化反应的进行.由图2b可知,pH值为7时,蛋白酶活性和淀粉酶活性整体均达到最大值,分别是289.67和159.34U/mL.温度是酶保持活性的重要因素[22],温度较高时会导致酶不可逆的失活,温度过低时,不能使酶的活性全部被激活.如图2c可知,在60℃时蛋白酶活性和淀粉酶活性达到最大值,分别为261.25和162.82U/mL.综上所述,热反硝化地芽孢杆菌最佳产酶生长条件为=24h、pH=7、=60℃.

2.2 水解反应时间影响

在500mL锥形瓶中加入200mL含固率为4%的剩余污泥,利用0.5mg/L的NaOH控制污泥pH值为7,向污泥中添加20%(酶液:污泥)嗜热菌粗酶液,在60℃下分别反应0,2,4,6,8,10和12h.水解时间对污泥蛋白质提取的影响如图3所示.

由图3a可知,随着时间增加,添加嗜热菌粗酶液的污泥反应体系中,各指标均不断升高,对蛋白质促进作用明显.在反应时间为2h时,蛋白质、氨基酸、多肽含量以及蛋白质提取率分别是848.3,153.6,513.7mg/L和13%,而在反应时间为8h时,分别为1611.3,230.5,1023.7mg/L以及25.8%,说明在2～8h时3种有机物含量均升高近一倍,这与Liu等[23]研究结果一致.随着时间增加,全部底物已与嗜热菌粗酶液结合,8h后增长趋势放缓,蛋白质提取率不再增加,且随着反应进行,多肽被酶分解为氨基酸小分子,多肽呈现先增加后减少的趋势.过长的反应时间伴随着能耗和成本增加,并且长时间反应会导致短链蛋白质的增加,因此最佳反应时间为8h.

剩余活性污泥絮体的形成过程十分复杂,有研究表明微生物絮凝成絮体主要是由于细菌为抵抗恶劣环境而产生的一种自身保护现象.随着试验反应进行,污泥絮体发生了明显的变化,颜色由原始的深褐色变为浅褐色,且颗粒变细,污泥颜色变化与宋勇[24]将水解酶投加至活性污泥系统结果一致.其污泥粒径变化见图3b.对比未经嗜热菌处理的剩余污泥,处理12h的剩余污泥粒径在0～10μm的明显增多,粒径为30～100μm的占比明显下降,平均粒径下降8.345μm.结果表明,嗜热菌粗酶液的溶胞作用导致絮体解体,污泥中的细菌裸露,随即酶作用于细菌使其破解,粒径显著下降.Chen等[25]对比了几种酶对提高剩余污泥水解和生物降解性的影响,并得出酶在破碎剩余污泥复杂结构起着重大作用.

2.3 嗜热菌不同接种量影响

接种量是嗜热菌粗酶液与剩余活性污泥的体积比.由图4a可知,蛋白质、氨基酸和多肽含量都是在接种量为5%～20%时迅速上升,在20%～25%时趋势变缓或下降.接种量5%～20%阶段,蛋白质、氨基酸、多肽三者含量分别增加了760,192.01,564.67mg/L,蛋白质提取率增加了12.19%,提取率达到32.05%.在20%～25%阶段,蛋白质、多肽含量以及蛋白质提取率分别减少146.67,182.15mg/L以及2.35%,氨基酸含量增加3.47mg/L.比较数据可得,在20%接种量之后污泥与酶反应达到饱和,过量的酶分解蛋白质导致其含量下降,蛋白质分解出的多肽也被过量的酶分解为氨基酸,因此,接种量为20%时,酶与底物充分接触,达到最佳效果.由图4b可知,污泥粒径不断下降,在接种比为20%时,相较原污泥,0～10μm粒径增加13%,10～30μm、30～50μm和50～100μm粒径分别减少5.4%、7.5%和1.1%,平均粒径由23.01μm下降至18.75μm.与Liu等[26]利用溶菌酶和鼠李糖脂联合处理剩余污泥的结果一致.

空白为原污泥添加不同接种量酶液后的初始蛋白含量;pH值为7,温度为60℃,含固率为4%,反应时间为8h.

2.4 污泥不同含固率影响

由图5a可知,氨基酸和多肽含量随着含固率增加不断上升,蛋白质含量在含固率1%～4%时上升,在4%～5%时下降,蛋白质提取率也随之下降.氨基酸和多肽含量随着含固率的增加不断上升,在含固率1%～5%时分别增加了199.53和642.31mg/L,在含固率为4%时分别达到359.6和1060.1mg/L,蛋白质在含固率1%～4%时上升660.1mg/L,提取率上升10.6%,达到25.9%,在4%～5%时下降206.67mg/L,提取率下降3.3%.如图5b所示,污泥粒径随着含固率增加而上升,相较1%含固率,在5%含固率时平均粒径增加3.49μm.其主要原因是酶在进行催化反应时,首先与污泥形成酶-底物复合物(ES)网络,分子间催化作用转变为分子内的催化作用[27],而含固率为5%时,絮体结构较为紧密,污泥与酶传质受到阻碍,导致酶难以与污泥形成ES复合物,进而影响水解效率,蛋白质含量下降,而其中不能与底物结合的酶将已溶出的蛋白质分解为氨基酸和多肽,因此含量上升.

pH值为7,温度为60℃,接种量为20%,反应时间为8h

2.5 污泥形态变化

由图6可知,原始污泥的絮体外包裹大量丝状结构,存在明显的丝状菌连接,污泥结构松散无序,絮体颗粒之间无明显边界.经过嗜热菌处理后的污泥,丝状菌开始断裂,污泥颗粒间相互缠绕现象已观察不到,污泥表面结构粗糙且相对紧密,边界清晰,出现有规则的孔隙结构,且具有更大的比表面积,污泥细胞结构经水解后受到破坏,胞内物质流出,释放水分,且其形态结构变化与薛飞等[28]研究结果相似.

a.原始污泥;b.处理后污泥

2.6 嗜热菌提取剩余污泥蛋白质响应曲面法优化实验

由单因素实验结果,确定反应时间()、含固率()和接种量()的取值范围(表2),以蛋白质提取率()为响应值,开展响应曲面实验.通过将响应面优化试验得到的实验值带入响应面分析表,并对其进行响应面回归分析(表3).

表2 响应曲面的实验因素及水平

2.6.1 回归模型的建立及统计分析 用Design Expert软件分析表的实验结果,得到回归方程为:= 32.09 + 1.36+ 0.11+ 1.84+ 0.32+ 0.48+ 0.43- 2.882- 6.782- 2.772.

由表4可知,该模型的值为44.54,且(rod>) < 0.0001,说明该模型极显著.相关系数2=0.9828>0.9,实验值与预测值相关性良好.决定系数2Adj=0.9608,该模型能够解释96.08%的响应值变化,回归性较好.信噪比Adeq Precision 16.879>4表明方程的拟合度较好,所以可用于嗜热菌提取剩余污泥蛋白质工艺优化.失拟项(>0.05)不显著,说明方程的拟合效果较好.对比自变量的值可得出,不同因素对蛋白质提取率影响次序:(接种量)>(反应时间)>(含固率).

表3 响应曲面实验设计及结果

表4 蛋白质回收率回归方程模型的方差分析

2.6.2 响应曲面分析及条件优化 响应曲面颜色越深,说明结果越显著,即蛋白质提取效果越好[29].响应曲面坡度越陡,表示响应量对实验条件的改变越敏感,等高线由椭圆向圆形演变表示交互作用的显著性逐渐减弱.

由图7a可见,蛋白质提取率()随着反应时间()和含固率()的增加先升高后降低,同时发现曲面坡度较大,并且表4的方差分析中的值为0.0416<显著值0.05,说明因素之间存在明显的相互作用并且影响显著.通过比较表4中值大小得出的显著性大于,说明反应时间对蛋白质提取率的影响大于污泥含固率.从图7b等高线图中可以看出,等高线较为密集且呈椭圆形,也表明了交互作用显著.

由图8a可见,蛋白质提取率()随着接种量和时间的增加先升高后降低,曲面坡度较小,并且表4的方差分析中的值为0.3233>0.05,通过比较表4中值得出的显著性大于,说明酶接种量对蛋白质提取率的影响大于反应时间.从图8b等高线图中看出,等高线较为稀疏,也表明相互作用不显著.

由图9a可见,蛋白质提取率()随着接种量()的提高不断增大,且随着含固率()的增大先升高后降低,曲面相对较为平坦,并且表4的方差分析中的值为0.3764>0.05,说明因素影响不显著.通过比较表4中值得出的显著性大于,说明酶接种量对蛋白质提取率的影响大于污泥含固率.从图8b等高线图中看出,等高线形状呈圆形,表明相互作用不显著.

综上所述,嗜热菌水解剩余污泥提取蛋白质过程中,单独的反应时间和接种量对蛋白质提取率都有显著影响,但是从两两结合角度出发,发现反应时间和酶接种量以及酶接种量和污泥含固率之间不存在显著的相互作用,而含固率和反应时间之间存在相互影响.

2.6.3 验证结果实验 根据Box-Behnken试验设计所得的结果和二次多项回归方程,通过Design Expert软件预测出蛋白质提取的最佳反应条件为污泥含固率4%、酶接种量20%、反应时间8h.在上述条件下,蛋白质提取率达32%以上,可以通过在最佳水解条件下进行水解来监测模型精确度,进行3组平行实验,污泥蛋白提取率为(32.11±0.13)%,从而可以得到通过响应面分析法对其最佳酶解条件进行优化是可行的.该模型能较准确地模拟各因素对蛋白质提取率的影响,具有较高的应用价值.

3 结论

3.1 嗜热菌水解法提取剩余污泥蛋白质的最佳提取条件为:含固率为4%、粗酶液投加量为20%、反应时间8h、反应温度60℃,反应pH=7.在该提取条件下剩余污泥蛋白质提取率的最大值可达32.05%.

3.2 通过响应面分析得到嗜热菌水解法提取剩余污泥蛋白质各因素的影响显著性由强至弱表现为:嗜热菌接种量>反应时间>剩余污泥含固率.

3.3 污泥粒径随着反应进行逐渐降低,其中污泥50～100μm减少1.1%,30～50μm减少7.5%,10～30μm减少5.4%,0～10μm增加13%,且通过扫描电镜可以看出污泥絮体颗粒变细,具有更大比表面积和更发达的孔隙结构.

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The extraction of protein from surplus sludge catalyzed by thermophilichydrolysis.

DING Ya-ting1,2,ZHONG Wei-zhang1,2*,QIN Xue1,2,NING Zhi-fang1,2,LI Yue1,2,CHEN Sai-nan1,2

(1.College of Environmental Science and Engineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China；2.Biotechnology Laboratory of Pollution Prevention and Control of Hebei Province,Shijiazhuang 050018,China).,2022,42(8)：3780～3787

For optimizing the processing conditions to realizing the harmless treatment and resource utilization of excess sludge,the thermophilic bacteria (),which can produce extracellular enzymes such as protease and amylase,were selected from the high-temperature compost substrate and used to extract sludge nitrogen source in this study. Then effects of reaction time,sludge solid content and inoculum amount of crude enzyme solution of thermophilic bacteria on protein extraction were evaluated to determine the optimum reaction conditions. The results show that effects of various factors on protein recovery during hydrolysis were in the order of inoculation amount > time > solid content; and the optimal processing conditions included pH=7,=60℃,=8h,and solid content of 4% under which we observed thermophilic bacteria inoculation rate of 20%,protein extraction rate of 32.05%,amino acid content of 359.6mg/L,and polypeptide content of 1060.1mg/L,and that the sludge supernatant particle size decreased gradually with the reaction.

thermophilic bacteria；hydrolysis；surplus sludge；protein；influencing factors

X703

A

1000-6923(2022)08-3780-08

2022-01-25

河北省人才工程培养资助项目(A201901043);河北省自然科学基金资助项目(B2021208067);国家自然科学基金资助项目(51708170)

* 责任作者,副教授,zhongweizhang@aliyun.com

丁雅婷(1998-),女,河北科技大学硕士研究生,研究方向为固体废物及废水无害化处理及资源化利用.发表论文3篇.