大黄素对慢性肾衰患犬肠道菌群及其代谢产物的影响

高岩松 朱道仙施洁 徐小琴

（江苏农牧科技职业学院动物医学院 225300)

近年来，我国宠物犬慢性肾衰病例越来越多，该病治疗成本高、周期长、并发症多，对宠物诊疗提出了严峻的挑战[1]。因此，如何延缓CRF 进程，提高患犬的生活质量成为宠物临床上的一个难题。研究表明，肠道菌群紊乱可促进慢性肾脏疾病的发展[2]，慢性肾病患者服用产短链脂肪酸（SCFAs）的益生菌或摄入SCFAs 能降低尿毒素和氧化应激水平、保护残肾功能和提高生活质量[3,4]。陆江等发现，慢性肾衰犬肠道菌群发生改变，且会促进慢性肾衰发生发展，提示肠道菌群可能成为犬慢性肾衰治疗的潜在新靶点[5]。大黄素是中药大黄的主要成分，临床实践发现，中药大黄灌肠能减少尿毒症毒素并改善肾脏功能。但其作用机制仍不清楚。因此，本试验从肠道菌群及其代谢物角度研究大黄素对犬慢性肾衰的治疗效果及可能机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物与设计

试验选择16 条5 岁左右体重（5kg±1）kg 的犬，试验前饲喂基础日粮7d 后，各犬按照20mg/kg 体重肌肉注射庆大霉素，连续10d，若血清肌酐（Cr）及临床症状无明显变化，则按40mg/kg 体重间隔12h 重复给药，直至血清Cr＞270μmol/L，尿素氮（UN）升高，停止用药。随机等分为2 组：慢性肾衰对照组和试验组。试验期间所有犬环境条件、基础日粮、饲养管理相同，试验组在饲喂基础日粮的基础上，按30mg/kg 体重口服给予大黄素，试验期30d。

1.2 生产性能观察

每天记录采食量、体温、心率、腹泻情况、体重等生理活动变化。

1.3 菌群结构及代谢产物检测

分别在试验第10、20、30d 经直肠采集无菌粪便，通过RT-PCR 技术检测各组犬肠道菌群中细菌种类及数量。采用粪样细菌DNA 提取试剂盒提取粪样细菌总DNA，吸取2μL 作为扩增样本，分别加入各目标细菌引物进行PCR 扩增，回收各细菌电泳条带作为阳性模板，采用RT-PCR 法检测各目标肠道细菌的拷贝数，使用Log (copies) 表示，引物设计见表1。同时采用气相色谱法检测短链脂肪酸。

表1 不同细菌RT-PCR 引物序列

1.4 血液中肌酐（Cr) 和尿素氮（UN) 含量测定

分别在试验的10、20、30d，经头静脉采血，分离血清，用试剂盒法检测Cr 与UN 含量。

1.5 数据处理

试验结果用“平均值±标准差”表示，采用SPSS 22.0 统计软件ANOVA 程序t 检验分析进行比较。p＜0.05 表示差异显著，p＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 大黄素对慢性肾衰犬临床症状的影响

由图1 可知，慢性肾衰对照组犬采食量及体重显著低于试验组（p＜0.05），呕吐及腹泻发生率高于试验组（p＜0.05）。试验期间，慢性肾衰对照组有3 只动物死亡，试验组无动物死亡。

图1 各组犬的临床表现（*,p＜0.05）

2.2 大黄素对慢性肾衰犬肠道菌群的影响

由图2 可知，随着饲喂时间推移，慢性肾衰对照组犬肠道中双歧杆菌及乳酸杆菌的数量逐步降低，而大肠杆菌的数量逐渐升高。给予大黄素后可回调这些细菌的变化。试验结束时，试验组双歧杆菌数和乳酸杆菌数显著高于慢性肾衰慢性肾衰对照组（p＜0.01），大肠杆菌数显著低于慢性肾衰对照组（p＜0.01）。

图2 大黄素对慢性肾衰犬肠道菌群的影响（**，p＜0.01）

2.3 大黄素对慢性肾衰犬肠道菌群代谢产物的影响

由表2 可知，与慢性肾衰对照组相比，试验组粪中乙酸水平无变化（p＞0.05）；试验组丙酸水平在第20 和30 天时分别显著升高（p＜0.05）；试验组丁酸水平在第20 和30 天时分别显著升高（p＜0.05）。

表2 大黄素对慢性肾衰犬肠道菌群代谢产物的影响 单位：μmol/g

2.4 大黄素对慢性肾衰犬肾功能的影响

由图3 可知，随着慢性肾衰的发展，血清肌酐和尿素氮含量逐渐升高。给予大黄素可以降低慢性肾衰犬血清中肌酐和尿素氮含量。

图3 大黄素对慢性肾衰犬肾功能的影响（**，p＜0.01）

3 结论与讨论

肌酐和尿素氮是机体代谢的产物，并经过肾脏排出体外，当肾脏衰竭时血液中的肌酐和尿素氮排出受阻，导致在血中积聚，因此它们是反映肾功能的重要指标。在本试验第10 天，对照组与试验组的血清肌酐和尿素氮均高于犬的正常参考范围，表明慢性肾衰造模成功。随着肾衰的发展，肌酐和尿素氮有升高趋势，而给予大黄素干预后，二者含量有降低趋势，说明大黄素可改善慢性肾衰患犬的肾功能。近年来的研究发现，肠道菌群紊乱可导致肠道细菌极其有害代谢物进入血液循环，通过介导炎症反应、肾脏纤维化及血管损伤等途径参与了慢性肾衰的进展[6]。本研究发现，慢性肾衰患犬肠道中双歧杆菌及乳酸杆菌等有益菌减少，大肠杆菌等有害菌增多，粪中丙酸丁酸含量降低；大黄素可提高慢性肾衰犬肠道中双歧杆菌及乳酸杆菌等有益菌数量，减少大肠杆菌数量，提高粪中短链脂肪酸水平，提示肠道菌群紊乱在犬慢性肾衰过程可能也发挥重要作用，大黄素改善犬慢性肾衰的作用可能与调节肠道菌群及其代谢物有关。