谭 浩 徐文杰 何忻宜 郑雷蕾
1.口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室 重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室,重庆 401147;2.重庆医科大学附属口腔医院,重庆 401147
在胚胎发育时期,颅颌面骨骼主要由神经嵴细胞和中胚层细胞发育而来。在局部生长因子及组织发生因子的调节下,间充质细胞逐渐分化为软骨细胞、成骨细胞等,并通过基质合成及矿物质沉积等方式使骨骼逐渐发育成形。在成骨和破骨两种骨代谢活动的协同及偶联调控下,发育成形后的颅颌面骨组织将继续改建,以完成骨量的增长并维持骨形态结构的稳定平衡。研究表明,颅颌面骨骼的发育过程和代谢过程都受到各类分子信号通路的转导调控。近年来,Notch 信号通路逐渐被证明也参与调控颅颌面骨的生长发育。
Notch 信号通路是一种进化上高度保守的通路,在细胞、组织、器官的分化和发育过程中起着关键调控作用。自1917年Morgan 等在翅膀边缘缺刻的果蝇中发现Notch 基因以来,已有大量的研究阐明了Notch 信号在骨发育和骨代谢疾病中的重要作用。例如,在颅颌面骨骼中,异常的Notch 信号会导致颞下颌骨关节炎、颅骨缺损、牙槽骨病理性吸收等,靶向调控Notch 信号对于控制这些疾病的发生发展具有重要意义。因此,本文将重点讨论Notch 信号在颅颌面骨骼发育及骨代谢中的作用,并分析其中的分子机制,旨在为相关疾病的防治提供新的思路。
哺乳动物的Notch 信号通路包括四种单通道跨膜受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)、五种跨膜配体(Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1 和Jagged2)和转录调控因子(CSL-DNA 结合蛋白)。Notch 受体的结构包括胞外区(Notch extracellular domain,NECD)、跨膜区(transmembrane,TM)和胞内区(Notch intra cellular domain,NICD)三个部分,其中NECD 主要负责结合配体,启动信号传导后被配体细胞所吞噬,而NICD 经γ-分泌酶的S3 裂解从细胞膜上分离出来并转运入核后负责控制下游靶基因的转录。重组信号结合蛋白-Jκ(recombination signal binding protein-Jκ,RBP-Jκ)是Notch 信号通路中的关键转录调节因子,通过与入核的NICD 及Maml 形成转录调控复合物,调控和激活靶基因的转录。Notch 通路的下游靶基因包括Hes 和Hey 家族蛋白,它们是进化上保守的碱性螺旋-环-螺旋类型的转录抑制因子,作为主要的Notch 效应分子直接影响细胞的分化及功能。
在颅颌面骨中,软骨向骨的转化最早开始于胚胎的第8 周,软骨细胞的生成及分化在其中起着决定性作用。软骨细胞的生成及分化起源于间充质细胞的聚集,随后经过软骨细胞增殖、软骨细胞肥大、基质分泌等过程逐渐分化成熟。研究表明,在正常的软骨分化过程中,Notch 受体的胞内段NICD 表达于肥大区,抑制Notch 信号通路将导致软骨细胞分化活跃,软骨增殖增加,从而导致骨形成减少。反之,在软骨细胞中过表达Notch1-NICD 信号,会导致软骨细胞前体增殖减少,软骨分化被抑制。以上研究证明,Nocth信号抑制软骨的增殖及分化,阻碍Notch 信号会加速软骨的形成。Notch 信号抑制软骨分化主要是通过抑制转录因子Sox9(SRY-related high mobility groupbox 9)来实现的,Sox9 主要负责翻译后修饰软骨分化相关基因。研究表明,Notch 下游靶基因如Hes1 和Hey1 的下调会增加Sox9 的表达,进而促进软骨分化。综上所述,Notch 信号通路可通过调节Sox9 的表达来抑制软骨细胞的分化,降低软骨的形成,并有利于软骨内成骨的发生。
在颅颌系统中,颅底、颅盖、髁突的骨骼都是以软骨内成骨的形式形成的。髁突软骨是颞下颌关节的重要生长区,对于控制下颌骨生长、维持颞下颌关节的正常结构与功能具有重要意义。同时,髁突软骨细胞的生成及分化也受到诸多因素的调节。有研究在髁突软骨增殖层细胞中检测到众多Notch 信号通路相关基因的表达。此外,Notch 信号也被发现活跃于髁突表面的纤维软骨干细胞中,并参与调控颞下颌关节的发育成形过程。应用γ-分泌酶DAPT 抑制髁突软骨细胞中的Notch 信号转导后,发现细胞增殖相关基因的表达降低,而Sox9 的表达明显增高,软骨细胞的分化被促进,提示Notch 信号通路促进了髁突软骨细胞的增殖而抑制其分化。国内有学者对小鼠颞下颌骨关节炎模型的髁突软骨行免疫组化分析,发现髁突软骨中Notch1、Jagged1、Hes5 的表达量显著升高,利用Notch 抑制剂DAPT 治疗可显著改善髁突软骨的破坏。以上研究证明Notch 信号参与调控髁突软骨的形成及分化过程,同时抑制Notch 信号可能是治疗颞下颌骨关节炎的一个新的治疗靶点。
骨缝生长是颅颌面骨特殊的生长发育方式之一,是指两骨块之间未骨化区域的骨质沉积,颅颌面骨缝包括颅骨缝、腭中缝以及上颌骨周四条骨缝。有研究表明,Notch 信号通路在调节颅缝融合方面起着重要作用,其突变会导致颅缝的早期融合。在由Jagged1突变引起的Alagille 综合征个体中,颅缝早闭被认为是典型特征之一。有研究在Jagged1 突变的颅缝中检测到Notch2 及Hes1 的高表达,其显著增强了该区域骨缝的成骨作用,并导致颅缝早闭。但不同类型颅缝中的Notch 信号可能发挥不同的作用。在小鼠和大鼠的正常颅缝融合中,后额缝在出生后的第一个月融合,而矢状缝仍保持开放。Liu 等的研究发现,Notch 相关上下游信号的mRNA 水平在大鼠后额缝融合过程中逐渐下降以促进骨缝的融合,却在矢状缝中逐渐上升以维持骨缝的持续开放。由此可见,Notch信号在两种颅缝中的适应性变化有利于维持颅缝的生理性融合与开放。以上研究提示,靶向调节Notch信号对于治疗颅缝早闭、维持颅缝正常生长发育具有重要意义。
成骨细胞来源于充质干细胞,沿着骨表面聚集,合成由胶原及其他蛋白质组成的类骨质,随后钙磷晶体在类骨质内不断沉积,类骨质矿化成熟。根据成骨细胞分化阶段的不同,Notch 信号可能具有不同程度的抑制或诱导作用。研究发现,Notch 信号的激活抑制早期前体成骨细胞的分化,促进中间成骨细胞的增殖,抑制成熟成骨细胞的形成。当Notch 信号在未分成熟成骨细胞中被激活时,成骨细胞分化受损,骨质形成减少。而在软骨膜细胞分化为前成骨细胞(中间期)的阶段,NICD 的表达促进了细胞增殖,其特征是骨髓腔内过量的未成熟编织骨和纤维化细胞。除此之外,不同的Notch 受体在成骨细胞生成及分化过程中也承担着不同的任务。Notch1 过表达通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路来阻碍成骨分化。成骨细胞特异性的Notch2 失活导致局部骨小梁的骨量增加,同时在体外也观察到成骨能力的增强。SiRNA转染靶向下调Notch3 的表达可促进正常下颌骨间充质干细胞中成骨相关转录因子的表达。Nocth4 被发现在人牙槽骨来源的骨祖细胞成骨分化中上调,提示Notch4 可能促进成骨分化。由此可见,Notch 信号对成骨细胞的影响并非单一的促进或抑制,不同类型的Notch 信号在不同的局部环境下可能发挥不同的功能。
破骨细胞来源于造血单核/巨噬细胞,其前体在RANKL 及M-CSF 等因子的作用下发生细胞融合,从而形成多核破骨细胞,具有去除矿化骨基质的能力。破骨细胞的生成及分化受到多种信号的调控,其中RANKL/RANK/OPG 轴起主要作用。Notch 信号通路也被证明是破骨细胞发生及分化的重要调控因子。根据破骨细胞的分化状态,不同的Notch 信号相关分子在其中发挥不同的功能。有研究认为,Notch 信号抑制破骨细胞的分化,例如在M-CSF 刺激下,缺失Notch1~3 的骨髓巨噬细胞分化成破骨细胞的速度反而加快。相反,另有研究表明,激活Jagged1 和Notch2可增强活化T 细胞核因子c1(Nuclear factor of activated T cells cl,NFATc1)启动子的活性和表达,从而促进破骨细胞的形成。NICD2 与NF-κB 的相互作用会导致NFATc1 的激活,而NFATc1 是调节破骨细胞形成的主要转录因子。在Notch2 功能获得模型中也发现破骨细胞数目增加,骨吸收活跃,从而导致明显的骨质减少。以上研究表明,Notch 信号对破骨细胞分化及功能的影响尚无定论,不同的Notch 受体在破骨分化过程中可能发挥不同的作用。
发育完成后的颅颌面骨在一生中都在进行不断地改建,通过成骨细胞及破骨细胞的作用来维持骨代谢动态平衡,以维持骨骼的正常形态与结构。牙槽骨是全身中变化最活跃的骨骼,在生理状态下,它随着牙齿的替换和移动而不断改建。而在病理状态下,受到刺激后的牙槽骨中破骨细胞异常活跃,骨代谢平衡被打破,导致牙周炎、种植体周围炎等疾病的发生。已有研究报道,Notch 信号与各类牙槽骨异常骨代谢活动的发生相关,靶向调控Notch 信号对于控制牙槽骨的代谢改建具有重要意义。
Notch 信号被证明与牙周炎牙槽骨吸收有关。Djinic Krasavcevic 等纳入80 例侵袭性牙周炎及慢性牙周炎患者,收集患者的各项临床指标及龈沟液进行mRNA 水平检测及线性回归分析。结果显示,Notch2 表达的上调影响侵袭性牙周炎患者的附着丧失,提示Notch2 的高表达可能是引起牙槽骨水平丢失的因素之一。另有一组临床研究同样也证实了这一点,他们发现龈沟液中Notch2 的高表达会加重侵袭性和慢性牙周炎所导致的牙槽骨吸收。然而,Notch1对牙周炎牙槽骨吸收间的影响仍有争议。有学者发现,侵袭性牙周炎龈沟液中Notch1 和Jagged1 的下调会引起更多的破骨细胞形成,从而导致更严重的牙槽骨吸收。然而另有研究发现,外周血中Notch1 的表达上调反而会加重牙周炎的程度,并指出牙周炎的恶化可能与Notch1 促进了外周血辅助性T 细胞17(helper T cell 17,Th17)的分化有关。龈沟液和外周血中Notch1 的表达水平为何对牙周炎的发生、 发展发挥作用效果不一,目前尚不清楚,其潜在机制需进一步被阐明。此外,Notch 信号还被证明在种植体周围炎相关骨吸收中发挥作用,研究显示,Notch1 下调和部分关键炎症调节因子表达上调的联合作用可能引起种植体周围炎中破骨细胞活性增加并导致骨吸收破坏,因此控制Notch 信号的表达水平,对预防种植体周围炎骨吸收的发生同样也具有重要参考价值。
在矫治力作用下,牙槽骨稳定有序的代谢改建保证了牙齿的高效移动,不当的矫治力会打破牙槽骨的骨代谢平衡。已有研究报道,Notch 信号受到机械应力的调控,研究发现,间歇性压缩应力下人牙周韧带细胞中的Notch2、Notch3、Hes1 和Hey1 的mRNA 表达均显著升高,表明机械应力可诱导激活Notch 信号通路。此外,在小鼠前成骨细胞中,间歇性应力可通过转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)通路显著上调Notch 靶基因的表达。这些研究提示,Notch 信号可能参与机械应力作用下的正畸牙移动周围骨改建。在大鼠的正畸牙移动模型中,发现Notch1 和Jagged1 在受压侧的牙周膜中高表达,且与加力时间呈正相关,应用DAPT 抑制Notch 信号后,牙移动距离增加,破骨阳性细胞数量增加,骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/细胞核因子κB 受体活化因子配基(receptor activator of NF κB ligand,RANKL)比值下降,提示抑制Notch 信号会导致压力侧破骨吸收活跃,促进正畸牙移动。鉴于Notch 信号系统的复杂性,有关其对正畸力作用下牙槽骨骨代谢的作用及机制,还需通过更多的研究来进一步阐明。
综上所述,Notch 信号与颅颌面骨骼发育及骨代谢有着密不可分的联系。Notch 信号在颅颌面软骨内成骨及骨缝成骨过程中活跃,它通过调控间充质干细胞、软骨细胞、成骨细胞的命运来维持颅颌面骨骼的正常发育,靶向调控Notch 信号有利于预防颅颌面骨畸形的发生。而Notch 信号在颅颌面骨代谢中的作用似乎尚无定论。这主要是由于成骨细胞及破骨细胞的生成及分化涉及多个阶段,并受到多种因素的调控,且Notch 信号通路也涵盖各类配体、 受体及下游靶点,从而导致不同的模式下激活的Notch 信号级联在特定环境中发挥其特定的功能。对Notch 信号的调控可能成为一种有效的骨组织工程策略,利用Notch 信号对颅颌面骨代谢的调控作用,靶向防治牙周炎、种植体周围炎以及不当矫治力所致牙槽骨代谢失衡可作为未来的研究方向之一。然而,目前对于Nocth 信号在颅颌面骨中的研究仍不够全面和深入,期待未来有更多研究将Notch 信号用于颅颌面骨骼发育及骨代谢相关疾病的防治中。