锰-铜双金属层状硅酸盐纳米酶的构筑及类酶活性

何贝贝，杨葵华，吕 瑞，2

（1.绵阳师范学院化学与化学工程学院,绵阳 621000；2.西南科技大学环境与资源学院,绵阳 621010）

酶是一类由活细胞产生的具有高效催化作用的蛋白质/RNA. 天然酶具有催化效率高、底物专一、反应条件温和等特点，是绿色化学理念下理想的催化剂［1］. 然而，由于酶的化学本质是蛋白质，在酸、碱、热等非生理环境中容易发生构象变化而失活，因此，极大地限制了其工业化应用［2］. 为解决这一问题，研究者们开始探寻通过化学合成的方法制备人工模拟酶，以代替天然酶行使催化作用. 随着纳米技术的飞速发展，纳米材料的类酶活性受到了人们的关注. 2004年，Scrimin等［3］首次发现了三氮烷功能化的金纳米粒子具有磷酸二酯酶活性，并将此活性归因于锌离子在金纳米粒子表面的协同作用，但彼时这一发现并未受到足够重视. 直至2007年，阎锡蕴课题组［4］发现了四氧化三铁纳米粒子具有与辣根过氧化物酶类似的催化活性，由此，单一纳米材料具有内在的类酶催化活性这一重大发现颠覆了人们对纳米材料只是生物惰性物质的传统认知，纳米酶也逐渐进入了人们的视野. 随后，不同纳米材料的类酶活性也被相继报道，包括贵金属、金属及其氧化物、碳材料及金属-有机骨架（MOF）材料等［5］.其中，过渡金属及其氧化物纳米酶因其价态的多样性、高的电子传导效率以及优异的催化性能而成为关注的焦点［6］.

近年来，以双金属或多金属为活性中心的纳米酶成为该类材料的发展方向之一. 首先，利用金属的多价态以及金属离子间的电子传导，可协同提高其类酶活性. Luo 等［7］构筑了一种含铁、锰的MOF纳米酶（Mn/Fe-MIL），发现结构中Mn和Fe的协同作用提高了电子传递效率，增强了材料的类氧化酶活性，且锰的加入还增强了材料对底物的识别能力，从而可选择性地用于有机磷农药的检测. 其次，利用不同金属的特性可构筑具有多酶活性的纳米酶. Liu等［8］通过溶胶凝胶法合成了Co1.5Mn1.5O4纳米酶，其中钴和锰的多价态使得该材料具有4种类酶活性（包括漆酶、氧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶），这些不同的类酶活性使其不仅能用于苯二酚类同分异构体的定量识别，还在生物传感和环境修复等领域有着极大的应用潜力. 最后，利用金属离子的路易斯酸/碱性，可增强对底物的亲和能力，进而提高类酶活性. Sun等［9］合成了一种具有类过氧化物酶活性的NiCo双金属氢氧化物（NiCo LDH），根据路易斯酸碱理论，结构中的三价钴为路易斯酸，可与作为路易斯碱的底物TMB结合，从而增强了材料对底物的亲和能力，提高了催化效率.

天然黏土因其大的比表面积和层间离子的可交换性，被广泛用作吸附剂、填充剂和载体材料等；但由于天然黏土层间的作用力强，使得片层难以剥离，导致其水分散性较差，从而限制了其在水介质中的应用. 1997年，Mann等［10］率先采用人工合成的方式，于常温下利用3-氨丙基三乙氧基硅烷与水合氯化镁为前体，一步合成得到了含镁的氨丙基功能化层状硅酸盐（又称氨基黏土），其具有2∶1型类滑石层状结构，中间是八面体水滑石络合的MgO/OH 链，两侧为氨丙基功能化的硅氧四面体，这类结构的材料可通过改变有机硅烷剂以及中心离子的种类，从而获得不同特性的层状硅酸盐. 与天然黏土相比，氨基黏土因侧链氨丙基在水中的质子化而获得良好的水分散性，且能在水中直接剥离为纳米单片，解决了天然黏土水分散性差的问题. 加之其合成条件温和、结构可调、功能可控且细胞毒性低，目前已广泛用于药物传输［11，12］、生物成像［13］及环境修复［14，15］等方面，但这类材料在催化领域的应用却鲜见报道.

本文受天然漆酶和锰过氧化酶的启发［16，17］，构筑了含锰-铜的双金属层状硅酸盐，并评价了其作为类漆酶和类过氧化物酶纳米酶的潜力，还探讨了双金属活性中心在其发挥类漆酶和类过氧化物酶活性中的作用，为理性构筑层状硅酸盐纳米酶提供了参考，也为其在生物传感、疾病诊疗及环境修复等领域的应用奠定了基础.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，分析纯），购自上海麦克林生化科技有限公司；二水合氯化铜（CuCl2·2H2O）、四水合氯化锰（MnCl2·4H2O）、2，4-二氯苯酚（2，4-DP）、4-氨基安替比林（4-AP）、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）、过氧化氢（30%）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、醋酸钠、冰乙酸和盐酸均为分析纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；漆酶（Laccase，1 U/mg）和辣根过氧化物酶（HRP，250 U/mg）为生化试剂，购自合肥博美生物科技有限责任公司.

ULTRA 55型200 kV场发射扫描电子显微镜（SEM，德国蔡司仪器公司）；LIBRA 200型透射电子显微镜（TEM，德国蔡司仪器公司）；X'Pert PRO 型X射线衍射仪（XRD，荷兰帕纳科公司）；Spectrum One型傅里叶变换红外光谱仪（FTIR，美国PE仪器公司）；ESCALAB 250Xi型X射线光电子能谱仪（XPS，美国赛默飞仪器公司）；Malvern Zetasizer Nano ZS 90型纳米粒度电位仪（上海思百吉仪器系统有限公司）；iCAP6500 型电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP，美国赛默飞世尔科技公司）；UV-2800A 型紫外-可见分光光度计［UV-Vis，尤尼柯（上海）仪器有限公司］.

1.2 实验过程

1.2.1 AMCP的合成 固定M/Si摩尔比为3∶4（M为锰与铜的总量），合成不同锰铜比的氨基黏土. 具体方法如下：称量0.1980 g MnCl2·4H2O 和0.5114 g CuCl2·2H2O，溶于20 mL 乙醇溶液中，超声10 min 使其溶解，然后逐滴加入1.3 mL APTES，混合均匀后于室温下搅拌18 h，离心分离，用乙醇洗涤3次后于60 ℃干燥，得到n（Mn）∶n（Cu）=1∶3的AMCP. 采用相同方法制备了Mn/Cu摩尔比分别为1∶7，1∶1，3∶1和7∶1的AMCP，分别表示为AMCP-1∶7，AMCP-1∶3，AMCP-1∶1，AMCP-3∶1和AMCP-7∶1.

1.2.2 AMCP的表征 通过SEM和TEM对AMCP的微观形貌进行表征，并利用XRD，FTIR对不同锰铜比的AMCP进行物相和结构鉴定. 随后，以AMCP-1∶3样品为例，用TEM分析其表面的元素分布，以探究Mn，Cu 元素在材料表面的分布情况. 最后，对3 种不同Mn/Cu 比的样品AMCP-7∶1，AMCP-1∶1 和AMCP-1∶7中Cu2p，Mn2p和O1s轨道进行XPS分析，以考察AMCP中各元素的价态及存在形式.

1.2.3 AMCP的类漆酶活性 向3.4 mL Tris-HCl缓冲液（0.1 mol/L，pH=7.0）中加入200 μL不同Mn/Cu比的AMCP（1 mg/mL），200 μL 2，4-DP（1 mg/mL）和200 μL 2，4-DP（1 mg/mL），于室温下反应5 min后，测定510 nm处的吸光度，通过下式计算表观反应速率（酶活），以评价材料的类漆酶活性.

式中：c（mmol/L）为产物浓度；V（mL）为反应液体积；t（s）为反应时间；V'（mL）为催化剂溶液体积.

1.2.4 AMCP 的类过氧化物酶活性 向3.7 mL 醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=4.0）中加入100 μL 过氧化氢（30%），100 μL TMB（2 mg/mL）和100 μL AMCP（1 mg/mL），得到4 mL 反应液，反应20 min 后，用紫外分光光度计测定652 nm处的吸光度A652nm，用式（1）计算酶活，以评价材料的类过氧化物酶活性.

1.2.5 AMCP 的催化动力学参数评价 将不同浓度的底物（2，4-DP，TMB，H2O2）加入相应的催化反应体系中，按照酶活性测定方法得到不同底物浓度下的表观反应速率（酶活），并根据Michaelis-Menten方程［式（2）］计算反应的动力学参数.

式中：v（mmol·L-1·s-1）为表观反应速率；［S］（mmol/L）为底物浓度；vmax（mmol·L-1·s-1）为最大初始反应速率；Km（mmol/L）为米氏常数.

1.2.6 AMCP的催化稳定性评价 将AMCP（1 mg/mL）于不同温度（30～90 ℃）下温育30 min后，冷却至室温，按照1.2.3节方法评价其类漆酶活性，并在相同条件下以天然漆酶作为对照，探究其温度稳定性. 将AMCP（1 mg/mL）置于不同pH值（3～9）的缓冲液中5 h，然后于中性条件下，按照1.2.3节方法评价其类漆酶活性，并在相同条件下与天然漆酶对比，探究其pH稳定性.

2 结果与讨论

2.1 AMCP的结构表征

由SEM和TEM照片［图1（A）和（B）］可知，合成所得AMCP的形貌依然保留了天然层状硅酸盐所具有的层状结构（红框内所示），且不随锰铜比的变化而改变（图S1，见本文支持信息），但动态光散射结果（图S2，见本文支持信息）表明，AMCP的粒径随着结构中锰比例的增加而增大. 以AMCP-1∶3为例，探究了各元素在材料表面的分布情况［图1（C1）～（C6）］，结果显示AMCP中的Mn，Cu元素均匀分布于材料表面，且铜在表面的分布明显多于锰. 随后，进一步通过ICP-MS测得AMCP-1∶3中Mn和Cu的含量分别为0.16 g/g和0.69 g/g，换算后得锰/铜的摩尔比约为1∶3.6，与理论值较为相符. 此外，XRD结果［图1（D）］显示，随着锰加入量的增加，AMCP的（002），（020，110）晶面衍射峰逐渐消失，且（001）晶面衍射峰向低角度偏移，说明随着Mn加入量的增加，其层间距变大，这可能是由于Mn的高价态使得层间阴离子增多，进而导致其（001）晶面间距变大. 最后，从红外谱图［图1（E）］可知，波数为3441 cm-1处的峰对应于伯胺中N—H的伸缩振动，2024和1618 cm-1处的峰对应于—NH3+和—NH2中N—H的面内弯曲振动. 此外，AMCP 结构中还有与硅烷前体有关的基团，如—CHx（2921，1480 cm-1），—Si—C—（1128 cm-1），—Si—O—Si—（1041 cm-1）以及—C—N—（951 cm-1）的吸收带，加之—Mn—O—（620 cm-1）和—Cu—O—（530 cm-1）基团的存在，说明AMCP保留了天然层状硅酸盐特征的官能团. 此外，当锰比例高（AMCP-7∶1）和铜比例高（AMCP-1∶7）时，相应金属-氧的振动峰更明显，说明铜和锰已键合在有机硅烷结构中.

Fig.1 Characterization of AMCP（A）SEM image；（B）TEM image；（C1—C6）elemental mapping；（D）XRD patterns；（E）FTIR spectra.（D，E）a. AMCP-1∶7；b. AMCP-1∶3；c. AMCP-1∶1；d. AMCP-3∶1；e. AMCP-7∶1.

采用XPS分析了不同锰铜比的AMCP中元素的化学态. 从图2可知，Mn2p3/2可分为3个峰，结合能为641.2 eV的峰归属于Mn3+，位于642.6 eV的峰归属于Mn4+，由于结合能在645～650 eV之间的峰不属于Mn的任何一种价态，因此，该峰应为Mn与环境或其它元素之间的相互作用所致（标示为Mn-other）.由计算结果可知，随着结构中铜比例的增加，Mn4+/Mn3+由1.04上升至2.00，说明溶液中Mn3+和Cu2+之间发生了电子转移，即Mn3++Cu2+==Mn4++Cu+，使得反应生成了Mn4+. 此外，当Mn/Cu摩尔比为7∶1时，Mn-other峰发生了明显的化学位移，说明Mn与环境之间的相互作用更强. 这是因为Mn比例增加后，由于铜含量较低，使得结构中有更多的Mn3+存在，不稳定的Mn3+更倾向于与环境发生相互作用，导致其电子更易被激发而逃逸，因而使峰的结合能向低的方向移动.

为证实AMCP中锰铜之间的相互作用，进一步测定了不同锰铜比下AMCP中Cu2p轨道的XPS谱，由于Cu2p轨道中的电子会自旋分裂为Cu2p3/2（930～935 eV）和Cu2p1/2（950～955 eV），结合能为933.1 eV 的峰对应于Cu+，934.6 eV处的峰对应于Cu2+，而结合能在940～945 eV处的峰属于铜的卫星峰，而937.3 eV处的峰归属于Cu与周围环境之间的相互作用. 通过探究Cu2p3/2轨道电子的结合能，可了解铜的化学态及其含量. 由图2可知，在加入锰后，Cu2p3/2可分为2个峰，分别对应于Cu+和Cu2+，且随着Mn比例的增加，Cu+的含量增加，说明加入Mn后，结构中的锰和铜之间发生了电子传递，证实了以上推测.

Fig.2 XPS spectra of AMCP（A）Cu2p；（B）Mn2p；（C）O1s.

从O1s的XPS谱图可知，结合能为532.0，531.5和529.9 eV的峰分别对应于羟基氧（OOH）、氧空位（OV）及晶格氧（Olatt）. 随着锰加入比例的增加，晶格氧和氧空位的含量也随之增加，由于晶格氧属于结构中的碱性位点，碱性位点的引入可以提高其对酸性组分如氧气的吸附，因此随着锰比例的增加，其表面的吸附态氧也随之增多. 研究表明，表面吸附氧/氧空位能够显著提高催化剂的催化活性［18～20］，因此，结构中锰的存在将有利于提高催化反应的效率.

2.2 AMCP的类漆酶活性评价

2.2.1 AMCP的类漆酶活性 漆酶是一种多铜氧化酶，其活性中心由4个铜离子构成，可在氧气存在下催化酚类或胺类化合物的氧化，同时将氧气还原为水. 由于漆酶的催化无需外加氧化剂，且不产生有毒产物，被认为是一种更加绿色的酶［16］. 以锰、铜为中心的材料均被报道具有类漆酶活性［21，22］，基于此，首先探讨了AMCP 的类漆酶活性. 按照1.2.3 节方法进行实验，由图3（A）可见，单独的2，4-DP，4-AP或二者混合物在反应时间内均无明显的吸光度变化，而加入AMCP后，产物在510 nm处出现了最大吸收，此现象与天然漆酶的表现一致，说明AMCP具有类漆酶催化活性. 此外，为进一步验证其活性来源，采用与AMCP-1∶1中等量的铜离子、锰离子和锰铜离子混合溶液在相同的条件下进行类漆酶活性测试. 结果发现，锰离子未表现出类漆酶活性，铜离子和锰铜混合离子溶液虽可催化2，4-DP的氧化反应，但其产物的吸光度远低于AMCP，说明AMCP的类漆酶活性来源于其结构中的铜和锰.

随后，考察了不同Mn/Cu 比对AMCP 催化活性的影响. 由图3（B）可知，随着锰加入量的增加，AMCP的催化活性增强，说明Mn的加入对其类漆酶活性具有促进作用. 但实验中发现，锰含量过高会导致材料的zeta电位值降低（图S2），表现为在水中的稳定性下降，因此后续选择AMCP-1∶1进行实验.

2.2.2 AMCP的催化稳定性评价 按照1.2.6节方法，对AMCP在不同温度和pH值下的催化稳定性进行了评价，结果示于图3（C）和（D）. 可见，漆酶在极端pH值下的催化活性均有所降低，而AMCP则能在pH=3～9范围内保持约90%的催化活性，说明AMCP 具有优异的pH稳定性. 此外，由图3（D）可知，随着温度的升高，天然漆酶的活性逐渐降低，当温度达到70 ℃后，漆酶因结构的塌陷完全失活；而此时AMCP仍保留了80%以上的催化活性，进一步说明AMCP具有更优异的温度耐受性. 综上，AMCP对极端温度和pH均有较强的耐受性，是一种理想的酶替代品.

2.2.3 AMCP 的类漆酶活性机理 首先，为探究AMCP 中各金属在其发挥类漆酶活性中的作用，在相同条件下合成了仅含锰的有机层状硅酸盐（AMP）和仅含铜的有机层状硅酸盐（ACP）作为对比. 以不同浓度（0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）的2，4-DP 为底物，按照1.2.5 节方法计算得到不同底物浓度下AMCP的表观反应速率，以底物浓度的倒数（c-1）为横坐标，反应速率的倒数（v-1）为纵坐标绘制Lineweaver-Burk 曲线，并进一步按照Michaelis-Menten 公式计算反应的米氏常数和最大初始反应速率，其中米氏常数（Km）是指达到酶促反应最大速率的一半时所需要的底物浓度，可反映出催化剂与底物之间的亲和能力. 一般而言，Km值越小，说明催化剂与底物之前的亲和能力越强. 表1中数据表明，AMCP的米氏常数值均远小于ACP，而最大初始反应速率提高，说明锰的加入可促进催化剂与底物之间的亲和作用，并提高催化反应速率，有利于催化反应的进行. 而分析不同锰铜比AMCP的催化动力学参数可知，随着结构中锰比例的增加，AMCP与底物反应的米氏常数值变化不大，但最大初始反应速率却明显增加，说明锰比例的提高可显著提高其催化效率. 为进一步探究AMCP中发挥类漆酶作用的活性位点，测定了ACP 的XPS 谱图（图S3，见本文支持信息），可见，ACP 中仅有Cu2+，结合前述AMCP 的XPS 分析结果可知，结构中锰比例的增加，其Cu+比例增大，因而可推断结构中的Cu+是其底物的结合位点，而铜和锰共同作为催化活性中心，通过协同作用加速底物的氧化，加之AMP的Vmax小于AMCP-7∶1，说明双金属之间的电子传导作用促进了金属价态之间的循环，也有助于底物的氧化. 这一结论也可从图3（A）中得到证实，图中锰铜离子混合溶液的类漆酶活性高于单独的铜离子溶液，说明锰铜之间的电子传递作用有助于其类漆酶活性的发挥.

Fig.3 Laccase⁃like properties of AMCP（A）The absorbance of different systems in laccase-like reaction and the relative solution colors（insets）. a. 2，4-DP+4-AP+AMCP；b. 2，4-DP+4-AP+Cu2++Mn2+；c. 2，4-DP+ 4-AP+Cu2+；d. 2，4-DP+4-AP+Mn2+；e. 2，4-DP+4-AP；f. 2，4-DP+AMCP；g. 4-AP+AMCP；（B）the laccase-like activity of AMCP with different Mn/Cu ratios；（C）pH stability of AMCP and laccase；（D）thermo-stability of AMCP and laccase.

Table 1 Laccase-like activity of ACP,AMP and AMCP with different Mn/Cu ratios

最后，为进一步阐释反应过程的内在机理，采用异丙醇（IPA）作为羟自由基捕获剂，对苯醌（BQ）为超氧自由基捕获剂，EDTA为氧空位捕获剂，通过考察加入自由基捕获剂后产物的吸光度变化说明体系中产生的活性氧物种（图S4，见本文支持信息）. 结果表明，当加入IPA 后，产物吸光度变化不明显，说明AMCP 发挥类漆酶活性过程中没有羟自由基产生，而在加入BQ 后，产物的吸光度均明显降低，说明AMCP发挥类漆酶活性依赖于超氧自由基，与相关类氧化酶的报道一致［23］. 此外，EDTA的加入也使得产物吸光度明显降低，说明催化剂中存在氧空位，与XPS分析结果一致. 研究表明，氧空位的存在可提高表面氧气的吸附与活化，进而对底物的氧化有促进作用［18］. 因此，结合以上结果可知，AMCP中锰和铜的同时存在，不仅可促进金属离子的价态循环，提高反应速率，还能利用双金属间的电子传导产生氧空位，从而促进氧气转化为超氧自由基，最终使得AMCP具有更优异的类漆酶活性.

2.3 AMCP的类过氧化物酶活性评价

2.3.1 AMCP的类过氧化物酶活性 按照1.2.4节方法，对AMCP的类过氧化物酶活性（POD）进行了评价. 由图4可知，在酸性条件下，体系中同时存在TMB，H2O2和AMCP时，反应20 min后溶液中有明显的氧化产物（TMBox）出现，这与天然辣根过氧化物酶（HRP）的反应一致，而不加AMCP和单独的TMB均不能显示相应的现象，说明AMCP具有类POD活性. 为了进一步探究其催化活性来源，以与AMCP-1∶1中等量的铜离子、锰离子和锰铜离子混合溶液在相同条件下进行测试对比. 结果表明，单独的锰离子、铜离子和锰铜混合离子溶液虽具有一定类POD 活性，但均不及AMCP，说明AMCP 的类POD 活性来源于其结构中的锰和铜. 此外，进一步考察了不同锰铜比材料的类POD活性，结果示于图4（B）. 可见，不同比例的AMCP 均表现出了一定的类POD 活性，且随结构中Cu 比例的增加，其类POD 活性增强.

Fig.4 POD⁃like properties of AMCP（A）UV-Vis spectra of different systems and the relative solution colors（insets）. a. TMB+H2O2+AMCP；b. TMB+H2O2+Cu2++Mn2+；c. TMB+H2O2+Cu2+；d. TMB+H2O2；e. TMB+H2O2+Mn2+；f. TMB；g. H2O2+AMCP；（B）the POD-like activity of AMCP with different Mn/Cu ratios；（C）the Lineweaver-Burk plots for AMCP with TMB；（D）the Lineweaver-Burk plots for AMCP with H2O2.

2.3.2 AMCP 的类过氧化物酶活性机理 为进一步探究AMCP 的类过氧化物酶机理，首先考察了AMCP与TMB反应的动力学行为，结果见图4（C）. 通过进一步计算其动力学参数可知，对于锰含量较多的AMCP-7∶1而言，反应的米氏常数Km为0.18 mmol/L，最大初始反应速率Vmax为2.48 mmol·L-1·min-1，而结构中铜比例高的AMCP-1∶7的Km则为0.24 mmol/L，Vmax为7.20 mmol·L-1·min-1，说明结构中锰的比例对其与TMB 的亲和能力影响不大，但铜比例高则对反应速率有促进作用. 由于结构中铜比例的增加，其最大初始反应速率Vmax提高，类POD活性也随之增强，可推测结构中的铜是其发挥过氧化物酶活性的活性中心. 此外，根据XPS分析结果可知，AMCP结构中存在Cu2+/Cu+以及Mn4+/Mn3+，且随着铜比例的增加，Mn4+的含量增加，根据路易斯酸碱理论可知，四价锰属于路易斯酸［24］，锰的引入增加了AMCP 结构中的酸性位点，而TMB 作为路易斯碱，更易于路易斯酸性位点发生相互作用. 由此可知，Mn在结构中是作为底物的结合位点存在.

随后，进一步考察了AMCP 与H2O2反应的动力学行为，分别评价了AMCP-1∶7 和ACP 与H2O2之间的稳态动力学行为. 由图4（D）的双倒数曲线进一步计算可知，其催化反应的米氏常数Km为64.22 mmol/L，小于ACP的87.96 mmol/L，说明AMCP-1∶7与底物的亲和力强于ACP，进一步证实结构中的Mn为底物结合位点. 此外，AMCP的Vmax为2.52 mmol·L-1·min-1，与ACP的3.20 mmol·L-1·min-1差别不大. 推测当结构中存在的锰时，锰的氧化性会使其与过氧化氢发生反应，因而使得材料与H2O2之间的亲和能力变强，但正因为锰与过氧化氢会首先发生反应，因而获得的还原产物还可继续与铜发生电子传递，从而促进铜电对的循环，因此使其可保持较高的催化速率. 这一推测也可从相应金属离子溶液的反应中得到证实［图4（A）］，锰离子自身的类POD 活性极弱，但与铜离子混合后的类POD 活性却明显高于单独的铜离子溶液，证明锰的加入可促进铜电对的循环，从而有助于其类POD 活性的提高.

最后，通过自由基捕获剂探究了体系中产生的活性氧，结果见图S5（见本文支持信息）. 可见，当加入IPA，BQ和EDTA后，产物的吸光度均明显降低，表明AMCP发挥类过氧化物酶活性时，体系中产生了羟自由基和超氧自由基，且材料中的氧空位也参与了其类过氧化物酶活性的发挥.

综上，推测了AMCP 发挥类POD 活性的机理：由于锰电对的电势高于铜电对，因此AMCP 中的Mn4+和Mn3+首先被过氧化氢还原为Mn2+；随后，过量的过氧化氢会继续与结构中的铜发生类芬顿反应，产生羟自由基和过氧自由基；而过氧自由基会继续转化为其共轭碱超氧自由基，被还原的Mn2+又可在羟自由基作用下氧化为Mn3+；Mn3+的存在又可促进Cu2+转化为Cu+，从而促进Cu2+/Cu+电对的循环；最终，反应产生的自由基会使TMB被氧化为TMBox. 相应的反应方程如下：

3 结论

采用一步溶胶凝胶法，在室温下合成了含有锰、铜的双金属层状硅酸盐AMCP. 微观形貌和结构表征结果表明，该材料保留了天然黏土特有的层状结构，且锰和铜在结构中具有多种价态，可促进电子的转移和氧空位的产生. 随后，对其类酶活性进行评价发现，AMCP 具有优异的类漆酶和类过氧化物酶活性，且这2种类酶活性可通过pH值进行调控，在酸性条件下表现为类过氧化物酶活性，而在中性条件下则表现为类漆酶活性. 此外，AMCP对极端温度和pH值均有较强的耐受性，是一种理想的天然酶替代品. 最后，通过对催化机理的探讨可知，结构中的铜为催化反应的活性中心，而锰的存在则提供了更多的酸性位点，加速了反应中铜电对循环，同时促进了材料表面氧气的吸附和活化，因而有效提高了其类酶催化性能. 作为一种新兴的纳米酶，AMCP 不仅具有理想的类酶活性，还能克服天然酶在极端环境下易失活的弊端，加之其合成工艺简单、成本低，在生物传感、疾病诊疗及环境修复等领域将具有更广阔的应用潜力.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/20220150.