2型糖尿病合并骨质疏松症患者血清CX3CL1、CCL3、CCL4与糖脂代谢、骨密度及骨代谢标志物的相关性

宋茜茜，尹飞，郭淑芹，姚明言，李志红

骨质疏松症是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)常见并发症，随着肥胖和老龄化人口增加，T2DM合并骨质疏松症的发病率不断增加，一项系统分析显示，T2DM患者骨质疏松的患病率为37.8%，且随着年龄的增长而增加[1]。骨质疏松症患者骨密度降低，骨脆性增加，发生骨折风险增高，生存质量严重降低。骨质疏松症由成骨细胞和破骨细胞间平衡紊乱引起，破骨细胞过度活化导致骨吸收增加是引起骨质疏松症的主要原因。趋化因子可调节白细胞和其他炎性细胞迁移和浸润，引起破骨细胞活化，在骨质疏松发病机制中发挥重要作用[2]。C-X3-C趋化因子配体1(C-X3-C chemokine ligand 1，CX3CL1)是一种膜结合趋化因子，可调节免疫细胞迁移和黏附诱导炎性反应，并可诱导破骨细胞分化，促使骨吸收[3]。细胞因子配体3(cytokine ligand 3，CCL3)是一种促炎性趋化因子，转录调节炎性反应过程，同时可促使破骨细胞前体迁移，破骨细胞分化，增加破骨细胞数量和大小[4]。细胞因子配体4(cytokine ligand 4，CCL4)在破骨细胞前体细胞中高度表达，可促使核因子-κB 配体(RANKL)介导破骨细胞前体细胞从骨髓迁移至骨表面，为破骨细胞分化增殖提供条件[5]。CX3CL1、CCL3、CCL4是否与T2DM合并骨质疏松症有关尚不清楚，目前缺乏相关报道，鉴于此，本研究拟检测T2DM合并骨质疏松症患者血清CX3CL1、CCL3、CCL4水平，分析其间关系，为临床诊治和预防提供借鉴，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年2月—2021年2月保定市第一中心医院内分泌二科收治T2DM患者322例，根据是否发生骨质疏松症将患者分为骨质疏松组115例和非骨质疏松组207例。骨质疏松组患者年龄、BMI、T2DM病程、既往吸烟史比例均大于非骨质疏松组(P<0.05)，补充钙剂比例低于非骨质疏松组(P<0.05)，性别、收缩压、舒张压、既往饮酒史、基础疾病等资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。本研究经医院伦理委员会审核批准(伦审2018063)，患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

表1 骨质疏松组与非骨质疏松组临床资料比较

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①T2DM符合“中国2型糖尿病防治指南(2017年版)”[6]诊断标准，骨质疏松症符合“原发性骨质疏松症诊疗指南(2017)”[7]诊断标准；②年龄18岁以上。(2)排除标准：①使用激素替代疗法、双膦酸盐、糖皮质激素、质子泵抑制剂等；②合并急慢性感染、自身免疫性疾病；③合并恶性肿瘤。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清CX3CL1、CCL3、CCL4检测：患者入组后均采集空腹肘静脉血3 ml注入干燥试管，待凝固后取上层液离心取血清待测。采用FK-SY96S多功能酶标分析仪(山东方科仪器有限公司)运用双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测血清CX3CL1、CCL3、CCL4水平。

1.3.2 糖脂代谢指标检测：上述血清标本，使用全自动生化分析仪(美国Beckman Coulter 公司，型号AU5800)测定三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。电化学发光分析仪(美国Roche 公司，型号Cobas 8000)测定空腹胰岛素(FINS)，高效液相色谱仪(美国Bio-Rad公司，D-10 系统)测量糖化血红蛋白(HbA1c)。另取静脉血标本，采用稳态血糖仪(美国强生公司)检测空腹血糖(FPG)，稳态模型计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。

1.3.3 骨代谢指标检测：上述血清标本，采用FK-SY96S多功能酶标分析仪运用酶联免疫吸附试验检测血清Ⅰ型胶原羧基端肽β-胶原特殊序列(β-CTX)、骨钙素N-端中分子片段(N-MID)、骨碱性磷酸酶(B-ALP)、Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PⅠNP)、Ⅰ型前胶原羧基端前肽(PⅠCP)、抗酒石酸盐酸性磷酸酶异构体5b(TRACP-5b)，试剂盒购自上海酶联生物公司。

1.3.4 骨密度测量：双能X线骨密度仪(美国Hologic公司，型号Discovery-WI)测定全髋、股骨颈和L1～4脊柱的骨密度(g/cm2)，取所有部位的骨密度平均值。

2 结 果

2.1 2组血清CX3CL1、CCL3、CCL4比较 骨质疏松组血清CX3CL1、CCL3、CCL4水平高于非骨质疏松组(P<0.01)，见表2。

表2 骨质疏松组与非骨质疏松组血清CX3CL1、CCL3、CCL4水平比较

2.2 2组糖脂代谢指标、骨代谢指标、骨密度比较 骨质疏松组HbA1c、HOMA-IR、TC、β-CTX、N-MID、TRACP-5b均高于非骨质疏松组(P<0.05)，B-ALP、PⅠNP、PⅠCP、骨密度低于非骨质疏松组(P<0.05)，FPG、FINS、TG、HDL-C、LDL-C比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 骨质疏松组与非骨质疏松组糖脂代谢指标、骨代谢指标、骨密度比较

2.3 血清CX3CL1、CCL3、CCL4与糖脂代谢、骨代谢指标、骨密度的相关性 血清CX3CL1、CCL3、CCL4与HbA1c、HOMA-IR、TC、β-CTX、N-MID、TRACP-5b均呈正相关(P<0.05)，与B-ALP、PⅠNP、PⅠCP、骨密度呈负相关(P<0.05)，与FPG、FINS、TG、LDL-C、HDL-C无相关性(P>0.05)，见表4。

表4 血清CX3CL1、CCL3、CCL4与糖脂代谢、骨代谢指标、骨密度的相关性分析

2.4 T2DM患者发生骨质疏松症的多因素Logistic回归分析 以骨质疏松症为因变量(赋值：0=否，1=是)， 以年龄、BMI、T2DM病程、既往吸烟史(赋值：0=否，1=是)、补充钙剂(赋值：0=否，1=是)、HbA1c、HOMA-IR、TC、β-CTX、N-MID、B-ALP、PⅠCP、TRACP-5b、骨密度、CX3CL1、CCL3、CCL4为自变量，建立多因素Logistic回归方程。结果显示，HbA1c、BMI、CX3CL1、CCL3、CCL4升高是T2DM患者发生骨质疏松症的危险因素(P<0.05)，补充钙剂是保护因素(P<0.05)，见表5。

表5 T2DM患者发生骨质疏松症的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

T2DM是一种常见疾病，高循环葡萄糖水平可导致视网膜病、糖尿病肾病、脑卒中和心肌梗死等微血管和大血管并发症，还可导致骨髓血管破坏，引起骨质疏松症。目前研究显示，晚期糖基化终产物在骨质中积聚、骨微血管损伤、慢性炎性反应状态、成骨细胞和破骨细胞失衡等与T2DM患者发生骨质疏松症有关[8]。骨组织生成及其吸收间平衡紊乱与骨质疏松症密切相关，趋化因子作为先天免疫系统的关键调节剂，通过自分泌和旁分泌机制控制炎性反应期间免疫细胞的迁移、定位和功能，影响破骨细胞和成骨细胞分化，调节骨形成和吸收，与生理和病理条件下骨重塑密切相关[9-11]。

CX3CL1是一种跨膜趋化因子，包含趋化因子/黏蛋白混合结构和跨膜结构域，具有黏附分子和趋化剂的双重功能，其编码基因位于染色体16q13，主要在活化的内皮细胞、活化的成纤维细胞和成骨细胞上表达，其特异性受体CX3C受体1(CX3CR1)在淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞和破骨细胞上表达，CX3CL1通过与CX3CR1结合发挥作用，包括促使免疫细胞对血管内皮细胞的捕获和牢固黏附，促使单核细胞募集炎性细胞，趋化其他趋化因子迁移等[12-13]。已知CX3CL1/CX3CR1轴与神经系统疾病、肾脏疾病、恶性肿瘤等多种疾病的发生有关[14-16]。本研究发现，骨质疏松组血清CX3CL1水平明显高于非骨质疏松组，且与HbA1c、HOMA-IR、TC呈正相关，表明CX3CL1参与T2DM糖脂代谢紊乱过程。CX3CL1/CX3CR1轴异常可导致M2极化巨噬细胞迁移减少，M1极化巨噬细胞迁移增加，损害葡萄糖耐量，降低胰岛素敏感性，导致胰岛素抵抗[17]。进一步分析显示，血清CX3CL1与骨密度和骨代谢指标有关，血清CX3CL1水平增高是T2DM患者发生骨质疏松症的危险因素，表明血清CX3CL1参与T2DM骨代谢紊乱及骨质疏松发生过程。CX3CL1/CX3CR1轴在破骨细胞募集和破骨细胞生成中也发挥重要作用。Han等[18]研究表明，CX3CL1在受电离辐射小鼠骨骼组织血管内皮中表达显著上调，CX3CL1促进外周循环中破骨细胞前体细胞高度表达CX3CR1，或通过激活缺氧诱导因子-1 α增加基质细胞衍生因子-1、巨噬细胞炎性蛋白-2等趋化因子生成，促使破骨细胞增殖，促进骨吸收。

CCL3也称巨噬细胞炎性蛋白α，属于低分子量趋化因子CC亚家族的成员，在单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中表达，参与炎性反应调节过程[19]。CCL3通过其受体—— CC趋化因子受体1(CCR1)促使单核细胞衍生巨噬细胞诱导滑膜炎性反应，参与膝关节骨关节炎进展[20]。本研究发现，CCL3与T2DM糖脂代谢异常有关，Sindhu等[21]同样发现，T2DM患者血清CCL3水平显著升高，趋化因子通过募集嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞至炎性反应部位促使炎性因子释放，参与代谢失调过程，与T2DM葡萄糖和脂质代谢紊乱及胰岛素抵抗有关。本研究结果表明，血清CCL3与β-CTX、N-MID、TRACP-5b均呈正相关，与B-ALP、PⅠNP、PⅠCP、骨密度均呈负相关，血清CCL3升高是T2DM患者骨质疏松症的危险因素之一。Collins等[22]发现破骨细胞中CCL3表达明显增强，其表达上调与死亡受体3/TNF样蛋白1A信号通路激活有关。Gong等[23]研究表明，细胞外信号调节激酶/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白通路激活可刺激骨髓来源的单核细胞产生CCL3，促使破骨细胞分化，而抑制CCL3可减少骨吸收和骨溶解。

CCL4也称巨噬细胞炎性蛋白-1β，属于CC趋化因子家族的成员，位于17号染色体，可驱使巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、未成熟树突细胞和冠状动脉内皮细胞，诱导炎性反应，导致心血管功能障碍，并损害外周肌肉组织对葡萄糖的摄取，参与动脉粥样硬化心血管疾病及T2DM发病过程[24]。本研究结果证实，T2DM患者血清CCL4水平与HbA1c、HOMA-IR、TC呈正相关，提示CCL4水平异常可能引起T2DM糖脂代谢异常。现有报道显示，CCL4可在胰岛β细胞炎性反应损伤中，通过驱使巨噬细胞迁移至胰腺引起胰岛β 细胞凋亡导致胰岛素敏感性降低和胰岛素抵抗[24]。Chang等[25]报道指出抑制CCL4可降低肿瘤坏死因子-α和白介素-6水平，维持葡萄糖稳态，降低TC、TG 和HDL-C水平，表明CCL4异常与糖脂代谢紊乱有关。本研究回归分析结果显示，血清CCL4升高是T2DM患者发生骨质疏松症的危险因素，CCL4与骨代谢紊乱和骨密度降低有关，提示CCL4可能参与T2DM骨质流失的过程。CCL4被认为是破骨细胞特异性基因，在骨吸收和迁移中起重要作用，Kim等[26]通过将RAW264.7细胞培养在骨表面孔中并用RANKL处理诱导破骨细胞分化，可观察到CCL4表达明显增高，表明CCL4参与RANKL诱导的破骨细胞迁移和分化过程，CCL4可能通过PI3K通路介导RANKL诱导的破骨细胞迁移过程[5]。

本结果显示，HbA1c、BMI与T2DM患者发生骨质疏松症也存在密切关系，表明血糖控制不佳及肥胖可能增加T2DM患者罹患骨质疏松风险，贾桠钧[27]也指出HbA1c水平与T2DM患者发生骨质疏松几率呈正相关。王剑等[28]报道结果也显示，肥胖患者骨质疏松症发生率较高。补充钙剂是骨质疏松症的保护因素，提示临床对于T2DM患者应注重钙剂补充，以预防骨质流失和骨量减少。

综上，T2DM合并骨质疏松症患者血清CX3CL1、CCL3、CCL4水平均升高，高水平血清CX3CL1、CCL3、CCL4与T2DM患者糖脂代谢紊乱、骨代谢异常和骨密度降低均有关，是T2DM患者合并骨质疏松症的危险因素。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

宋茜茜：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写，论文修改；尹飞、郭淑芹：实施研究过程，资料搜集整理；姚明言：进行统计学分析；李志红：提出研究思路，分析试验数据，论文审核