铁死亡在肾纤维化中的作用研究进展

李磊，夏煜琦综述 程帆审校

铁死亡是一种铁依赖性的新型程序性细胞死亡方式，细胞发生铁死亡时通常伴随铁的大量积累和脂质过氧化。这种独特的细胞死亡方式由铁依赖性磷脂过氧化驱动，受多种细胞代谢途径及信号通路的调节，包括氧化还原稳态、铁代谢、线粒体活性、氨基酸、脂质和糖代谢[1]。肾间质纤维化是各种肾脏疾病如肾小球肾炎、肾结石及肾积水等致肾损伤疾病的共同病理变化，最终进展为慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)，其主要病理特征为炎性细胞浸润，成纤维细胞增殖和细胞外基质过度沉积[2]。大量研究表明，铁死亡在多种肾脏疾病导致肾纤维化过程中发挥重要作用，尤其是致肾损伤性疾病，文章就此展开综述。

1 铁死亡概述

1.1 铁死亡定义 铁死亡于2012年首次由Dixon等[3]提出，是一种区别于细胞坏死、自噬及凋亡的新型细胞死亡方式。其与细胞坏死、自噬及凋亡的区别主要体现在以下3个方面：(1)形态学区别。通过透射电子显微镜发现，细胞铁死亡不出现凋亡所特有的染色质浓缩和边缘化、坏死所特有的细胞质和细胞器肿胀及质膜破裂、自噬所特有的双膜封闭囊泡现象。(2)生物化学区别。铁死亡能被多种可以抑制细胞坏死、自噬及凋亡的化合物(例如环孢菌素A、氯喹、3-甲基腺嘌呤等)差异化调节。此外，通过测试不同细胞死亡方式诱导剂诱导细胞死亡的能力，发现铁死亡诱导剂erastin和RSL3不同于其他细胞死亡形式的诱导剂。(3)遗传学区别。通过对细胞线粒体基因库的分析，发现铁死亡由一个独特的遗传网络所调控，敲除该调控网络中的关键基因可以抑制细胞铁死亡，但对细胞坏死、自噬及凋亡无明显影响[3]。

1.2 铁死亡主要特征 铁死亡主要以谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)活性降低和脂质过氧化物沉积为特征[4]。在细胞形态及细胞生化水平上具有独特的特征：在细胞形态方面，细胞发生铁死亡后表现为线粒体密度下降，线粒体嵴减少或消失，线粒体外膜破裂，但细胞膜保持完整，细胞核大小正常且染色质不发生凝集；在细胞生化方面，细胞发生铁死亡后，由于氧化和抗氧化系统失衡，导致细胞内脂质过氧化产物和活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量堆积[5-7]。

1.3 铁死亡主要发生机制

1.3.1 抗氧化系统失衡：半胱氨酸/谷胱甘肽反转运蛋白又被称为系统Xc-，其本身为一种跨膜蛋白，是细胞内重要的抗氧化系统组分。系统Xc-广泛分布于磷脂双分子层中，是由2个亚基 SLC7A11和 SLC3A2组成的异源二聚体，可调控谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成[8]。GPX4是一种利用GSH催化哺乳动物细胞发生还原反应的硒蛋白酶，它能将有害的脂质氧化物还原为无害的脂质醇，进而防止细胞发生氧化损伤，抑制细胞铁死亡[9]。作为细胞解毒系统的重要组成成分，GPX4的活性受细胞内GSH水平所调控。目前，研究发现，多种铁死亡诱导剂(如FINO2、RSL3及erastin)通过耗竭GSH或者直接抑制GPX4活性，诱导细胞内抗氧化系统失衡，导致ROS在细胞内堆积，使细胞发生氧化损伤进而引发细胞铁死亡[10]。因此，细胞内的抗氧化系统是防止ROS堆积及细胞氧化损伤的天然屏障，各种病理状态下抗氧化系统的失衡可以诱导细胞发生铁死亡，进而造成机体损伤。

1.3.2 铁代谢异常：铁是生物体内大多数分子物质的组成成分，能够参与多种细胞内生物化学反应。铁的存在形式有Fe2+和Fe3+2种。食物中Fe3+在肠道被还原为Fe2+并被小肠上皮细胞吸收。Fe2+通过膜转运蛋白被运输至细胞外，并被多铜氧化酶氧化为Fe3+，Fe3+与转铁蛋白(transferrin, Tf)结合形成TF-Fe3+复合物，经血液循环，运输至各组织器官。随后，Fe3+被转运入细胞内，并在金属还原酶STEAP3的存在下被还原为Fe2+，继而被释放到胞质的动态铁池中[11]。在正常生理状态下，动态铁池能够维持正常的铁平衡。然而，在细胞发生铁死亡时， Fe2+在细胞内聚集，并通过氧化反应产生大量ROS，这些ROS通过芬顿化学反应介导脂质过氧化并加重组织损伤。磷脂氢过氧化物(PLOOHs)是一种基于脂质的ROS形式，已被证实在铁死亡中发挥重要作用。Fe2+和Fe3+可以与PLOOHs反应分别生成自由基PLO·和PLOO·，从而诱发破坏性的过氧化链式反应，导致细胞氧化损伤[12]。此外，如前所述，铁的吸收、运输及储存都可以影响动态铁池平稳。研究表明，铁储存蛋白的自噬降解作用和Tf与受体的结合可以增加细胞内铁的含量，前者为细胞缺铁或受到氧化应激刺激时，铁蛋白自噬被激活，向外释放游离铁；后者则是细胞通过内吞转铁蛋白受体1(transferrin receptor protein 1，TfR1)与含铁的Tf相结合后形成的Tf-TfR1复合物，将铁从Tf中释放出来[13-14]。细胞内游离铁的含量增加，促进细胞发生铁死亡。反之，通过增强细胞内铁的输出可以抑制细胞铁死亡[15]。因此，目前认为铁是铁死亡的必要元素，铁代谢异常是铁死亡的必要过程。

1.3.3 异常脂质过氧化：铁依赖性的脂质过氧化也参与了细胞铁死亡进程。脂质过氧化是指氧化剂从多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)的磷酸二烯丙酯中获得不稳定氢原子并产生大量自由基和过氧化氢的过程[16]。酰基辅酶A合成酶长链家族成员 4 (acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL4)、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 3 (lysophosphatidylcholine acyltransferase 3, LPCAT3) 和花生四烯酸15-脂氧合酶 (arachidonate 15-lipoxygenase, ALOX15)是调节脂质过氧化的关键酶。其中，ALOX15被认为是细胞铁死亡的关键调节因子，并可能通过促进脂质自氧化从而启动脂质过氧化过程， ACSL4和LPCAT3则可以激活游离的长链多不饱和脂肪酸，促进溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，LPC)转化为卵磷脂，并参与氧化细胞膜磷脂的合成，从而导致细胞发生铁死亡[17-18]。

2 铁死亡与肾纤维化

2.1 铁死亡与肾结石 肾结石是一种常见的泌尿系统疾病，其发病率高达14.8%，复发率高达50%，0.8%～17.5%的肾结石患者患有CKD[19-20]。研究发现，肾间质纤维化相关基因在结石患者中显著上调，草酸钙(CaOx)晶体可以黏附和聚集在肾小管上皮细胞，导致肾小管上皮细胞损伤和内皮间质转化，最终导致肾纤维化[21-23]。研究发现，在高草酸尿小鼠和草酸刺激的HK-2细胞中，ROS水平显著增加[23]，表明铁死亡可能参与了肾结石的形成。此外，最新研究发现，CaOx晶体可以诱导肾小管上皮细胞发生铁死亡，导致肾小管上皮细胞损伤和肾损伤。研究发现，将肾小管上皮细胞暴露于各种浓度的CaOx晶体溶液中，随着CaOx晶体浓度的增加，肾小管上皮细胞中铁死亡激动蛋白P53、ACSL4、转铁蛋白受体(TRC)及TF表达显著升高，而铁死亡抑制蛋白、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)及GPX4的表达相对减少，同时由于CaOx晶体的刺激，线粒体功能受损而无法发挥抗氧化能力，导致ROS在细胞内积聚，最终诱导细胞发生铁死亡，而使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1可以抑制铁死亡从而减轻肾小管上皮细胞损伤[24]。此外，Song等[25]在草酸盐诱导肾结石的细胞模型中发现，CaOx晶体能通过自噬诱导铁死亡，从而加重肾损伤。BECN1是调节自噬活性的分子，实验通过BECN1过表达使细胞中丙二醛(MDA)、Fe2+、ROS显著增加，促进CaOx晶体诱导铁死亡发生。核受体共激活因子4(NCOA4)是一种广泛表达的细胞内蛋白，可以介导铁蛋白自噬作用以控制细胞内铁的释放和储存，研究发现，敲除NCOA4基因抑制了铁蛋白降解，甚至逆转了BECN1的影响。其他研究表明，铁死亡除了参与肾结石引起的细胞损伤外，也参与肾损伤修复过程，肾小管上皮细胞的持续性损伤可以导致炎性近端肾小管细胞的积累，而炎性近端肾小管细胞可通过显著下调GSH代谢基因，使细胞更容易发生铁死亡，导致肾损伤后修复失败，最终促进肾纤维化及急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)向CKD的发展[26]。尽管目前认为铁死亡与肾结石诱导的肾纤维化进展有关，但具体机制仍待进一步探讨。

2.2 铁死亡与肾积水 肾积水是指尿液从肾盂中排出受阻，蓄积后肾内压力增高，导致肾盂肾盏扩张、肾实质萎缩及肾脏功能减退。研究发现，肾盂积水不仅会导致肾脏损伤，也会诱导肾纤维化，且肾纤维化与肾盂积水的严重程度呈正比[27-28]。同时，研究表明，铁死亡参与了肾积水导致的肾纤维化过程。Zhang等[29]发现在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)诱导肾积水小鼠模型中，肾小管上皮细胞发生了铁死亡，同时，体外研究表明，铁死亡抑制剂 liproxstatin-1 (Lip-1)能缓解肾纤维化和细胞外基质沉积。其机制可能为Lip-1 抑制肾小管上皮细胞分泌促纤维化相关因子，最终抑制肾小管周围成纤维细胞的活化。Smad3是一种常见的信号传导蛋白，可以作为转录因子直接促进促纤维化基因的表达。最新研究发现，在UUO诱导的肾积水小鼠模型中，铁死亡生物标志物GPX4的表达显著下降，并伴随Smad3的异常激活从而促进纤维化。此外，鹫尾苷元作为Smad3磷酸化的抑制剂，可能通过抑制Smad3介导的铁死亡来抑制UUO小鼠的肾间质纤维化[30]，进一步证明铁死亡与肾积水所致肾纤维化密切相关。

2.3 铁死亡与肾缺血再灌注 缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)是指遭受一定时间缺血的组织及细胞恢复血流后，组织损伤程度较前增加的病理现象。肾脏对IRI尤其敏感，常见于移植肾、肾部分切除手术患者中，它会诱发AKI导致肾功能显著降低、肾脏组织结构破坏，并最终引起肾纤维化。Zhou等[31]在构建的小鼠肾脏IRI模型中通过Western印迹和免疫组织化学染色技术手段发现，肾小管上皮细胞中GPX4降低和4-羟基壬烯酸(脂质过氧化产物之一)增加，提示在IRI小鼠肾脏组织中发生了铁死亡。此外，临床上IRI是心脏手术后AKI的主要原因。一项前瞻性队列研究表明，心脏手术后发生AKI的患者术中铁结合蛋白水平较低，反映了体外循环术后释放的游离铁未被重吸收，引起循环铁增加，最终导致肾损伤[32]。铁调素-25(hepcidin-25)是预测心脏手术后是否发生肾损伤的可靠标志物，同时也是一种与AKI相关的铁调节蛋白。研究发现，hepcidin-25可能通过结合心脏手术过程中释放的游离铁，从而抑制铁死亡，减轻IRI诱导的肾小管损伤、氧化应激及炎性反应，进一步表明铁死亡在肾IRI中起重要作用[33]。Pannexin 1(PANX1)作为一种介导ATP释放的跨膜通道蛋白，研究发现其能加重IRI的肾脏损伤。抑制PANX1的表达不仅能抑制Erastin诱导的铁死亡，同时通过MAPK/ERK途径增加细胞保护性伴侣血红素加氧酶-1的表达，进而抑制嗜铁蛋白产生，缓解肾脏在围术期中IRI导致的损伤[34]。同时，研究发现，特异性敲除小鼠GPX4相关基因可以导致脂质过氧化物在细胞内积累，诱导细胞发生铁死亡，进而加重IRI小鼠的肾脏损伤，最终导致肾纤维化，而应用铁死亡抑制剂可以减轻肾脏IRI并缓解肾纤维化[35]。

2.4 铁死亡与药物所致肾损伤 肾脏在物质排泄、体液和电解质平衡及机体内环境稳态等方面起着重要作用，同时也容易受到药物毒性影响。药物引起的肾损伤可以造成肾小球和肾小管的结构破坏，导致肾功能下降和肾纤维化。叶酸(folic acid，FA)是一种B族维生素，临床上主要用于各种原因引起的贫血及大剂量下联合其他抗肿瘤药物治疗转移性胃肠道肿瘤，后者常致肾脏损伤。在FA诱导的肾损伤模型中，细胞内线粒体的自噬和能量代谢受损，导致ROS产生增加及GSH水平降低，最终加重肾小管损伤和间质纤维化。Li等[36]发现在FA诱导的AKI小鼠模型中，铁死亡相关分子明显激活，抑制铁死亡可以抑制小鼠体内炎性反应，在FA诱导的早期肾损伤中发挥保护作用，延缓肾纤维化进程。顺铂作为治疗多种恶性肿瘤的药物之一，由于其产生的肾毒性等相关不良反应，临床应用受到限制。20%～35%的患者在服用顺铂后会出现AKI[37]。最新研究发现，在顺铂诱导的AKI模型中，小鼠肾组织细胞内脂质过氧化物显著增加，GSH水平显著下降，GPX4活性降低及细胞内游离铁含量增加，抑制铁死亡能够减轻顺铂导致的肾损伤及间质纤维化[38]。上述结果表明，某些药物通过铁死亡方式导致肾脏受损，靶向铁死亡治疗可以保护肾脏免于药物不良反应，为患者提供新的治疗选择。

2.5 铁死亡与慢性肾脏病 CKD是各种原发性和继发性肾病持续进展至后期的共同结局，表现为肾间质纤维化，肾功能进行性下降[39]。研究发现，大多数CKD患者会出现不同程度的铁代谢和脂质代谢紊乱。铁代谢紊乱导致铁在肾脏中沉积，进而诱导铁死亡；脂代谢紊乱导致肾实质脂质沉积，促进脂质过氧化，进一步诱导铁死亡[40]。此外，铁死亡介导的上皮细胞死亡过程会促进各种促纤维化因子如TGF-β、CTGF等的分泌，诱导间质成纤维细胞的增殖和分化，最终导致肾纤维化。Naito等[41]发现铁螯合剂地拉罗司可以抑制 TGF-β1/Smad3、炎性反应和氧化应激等通路，减轻CKD大鼠的肾纤维化。CKD中铁代谢和脂质代谢紊乱会导致铁死亡，加重肾损伤，靶向铁死亡的治疗方式可能为CKD患者肾功能保护发挥重要作用。

3 靶向铁死亡治疗肾纤维化

Lip-1是铁死亡的有效抑制剂，可以阻断脂质过氧化反应，减少脂质过氧化物的产生，从而抑制细胞铁死亡[42]。研究发现，在UUO诱导的肾纤维化大鼠中，Lip-1可以通过抑制肾小管上皮细胞铁死亡缓解肾纤维化进展[29]。其机制主要为Lip-1可以抑制肾小管上皮细胞中促纤维化因子的表达，从而间接抑制成纤维细胞的增殖和活化。此外，Lip-1不会干扰其他经典类型的细胞死亡方式，是一种安全有效的药物。妥珠单抗是一种新出现的IL-6受体(interleukin-6 receptor，IL-6R)靶向药物，可以和IL-6R特异性结合并阻断IL-6的下游信号传导[43]。最新研究发现，妥珠单抗治疗后的UUO小鼠GPX4和铁蛋白水平显著升高，表明妥珠单抗具有抑制细胞铁死亡的能力。同时，妥珠单抗可能通过阻断ERK通路的信号传导，抑制肾纤维化相关蛋白的表达，例如纤维连接蛋白、胶原蛋白及α-平滑肌肌动蛋白，进而缓解肾纤维化进程[44]。罗沙司他(FG-4592)是一种新型的缺氧诱导因子小分子稳定剂，可以抑制脯氨酸羟化酶的表达，使缺氧诱导因子的α亚单位在正常氧条件下降解。临床上，CKD患者口服FG-4592可改善贫血症状。最新研究表明，在FA诱导的AKI小鼠模型中，腹腔注射FG-4592可以通过AKT/GSK-3β介导的NRF2活化途径，抑制细胞铁死亡，从而延缓肾纤维化进程[36]。因此，FG-4592可能成为减轻FA所致AKI，延缓肾纤维化的治疗药物之一。

4 小结与展望

铁死亡作为一种新型的细胞死亡方式，可参与肾结石、肾积水、肾缺血再灌注损伤、药物所致肾损伤等多种肾脏疾病所致肾纤维化进程，靶向铁死亡的治疗方式可能为各种肾损伤导致的肾纤维化患者的肾功能保护发挥重要作用。