感染性心内膜炎患者外周血中性粒细胞外诱捕网水平与T细胞水平表达和预后的相关性研究

李 珂，宋莉莉，纪德江，赵会芹，王海平

（青岛阜外心血管病医院a.心外科；b.心内科，山东青岛 266034）

感染性心内膜炎(infective endocarditis，IE)是致病微生物经血路直接侵犯到患者心脏瓣膜、心内膜及大动脉内膜所致的炎症性疾病，多发于先天性心脏病、风湿性心脏病及免疫力低下人群[1-2]。感染、炎症等可激活机体免疫系统，产生细胞因子，中性粒细胞是天然免疫中数量最多、反应最快的细胞，在感染性疾病中扮演重要角色。当病原体感染时，中性粒细胞可通过吞噬、脱颗粒，产生中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular trap nets，NETs )来攻击入侵的病原体，另外中性粒细胞也参与适应性免疫，可作为抗原提呈细胞向T 细胞提呈抗原，从而间接调控T 细胞免疫[3-4]。NETs 是活化的中性粒细胞释放的可限制病原体扩散的胞外纤维，除能够抑制病原体生长与定植外，有研究发现，病原体可在NETs 中存活，且会对内皮细胞造成损伤，表明NETs 的释放也有促进病原的致病作用[5]。目前NETs 在系统性红斑狼疮[6]、类风湿关节炎[7]、糖尿病[8]、肿瘤[9]等疾病多有报道，但在IE 患者中NETs 水平变化未见报道。本研究旨在观察IE 患者外周血NETs 水平变化，并探讨其与T 细胞水平表达和患者预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年11月～2021年2月在青岛阜外心血管病医院治疗的53 例IE 患者作为IE 组，其中男性32 例，女性21 例；年龄18～76（56.54±13.43）岁；其中8 例无基础心脏疾病，18 例非风湿性心脏病，14 例先天性心脏病，7 例风湿性心脏病，4 例人工瓣膜植入，2 例心脏起搏器植入。纳入标准：①临床症状及生化指标符合IE诊断标准[10]；②两次血培养阳性；③经超声心动图确诊；④患者知情同意。排除标准：①非IE 患者；②并发其他感染性疾病；③并发免疫系统疾病者；④并发恶性肿瘤者；⑤并发血液系统疾病者；⑥并发认知功能障碍者；⑦妊娠及哺乳期妇女。另选取同期进行体检的50 例健康人群作为对照组，其中男性25例，女性25例，年龄18～75（55.32±12.35）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（χ2=1.121，P=0.290；t=-0.098，P=0.922），具有可比性。本研究经青岛阜外心血管病医院医学伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 高速离心机(Heraeus Fresco 21)，Fluoroskan 荧光酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；Pico Green 荧光染料（ 德国Leukocare AG 公司）；流式细胞仪(BD-FACS Calibur)及配套试剂（美国BD 公司）；BC-5390 血细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗公司）；PHILIPS iE33 多普勒超声诊断仪（上海欧启电子科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 资料收集及生化指标测定：收集IE 患者和对照组的一般临床资料，包括性别、年龄、病因，采用血细胞分析仪测定外周血白细胞(white blood cell，WBC)计数，中性粒细胞(neutrophil，NEUT)比例等指标。采用超声心动图检测患者左心室舒张期末内径(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)等。

1.3.2 外周血游离DNA/中性粒细胞胞外诱捕网陷阱（cf-DNA/NETs）水平和T 细胞水平表达检测：IE 患者于入院次日，对照组于体检当日采集空腹肘静脉血各6 ml，置于EDTA 真空采血管中，室温静置10 min 后进行离心(3 000r/min，10 min)，取上层血浆，-80℃保存备用。室温解冻血浆样本，取100μl 血浆注入血培养瓶，加入PicoGreen 荧光染料避光孵育5 min 后，接种于96 孔板内，采用荧光酶标仪检测样本荧光值，根据标准曲线计算cf-DNA/NETs 水平。采用流式细胞仪检测T 淋巴细胞亚群CD3+，CD4+，CD8+，计算CD4+/CD8+，检测方法严格按照说明书操作。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计数数据以n（%）表示，组间比较采用χ2检验，计量数据符合正态分布以均数±标准差（±s）表示，使用独立样本的t检验比较两组血浆NETs水平和T 细胞表达水平之间的差异；采用Pearson相关性检验分析IE 患者血浆NETs 水平与T 细胞水平表达的相关性；采用受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析血浆NETs 水平对IE 患者死亡的预测价值，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者生化指标及T 细胞水平表达比较见表1。IE 组患者cf-DNA/NETs，WBC，NEUT，hs-CRP，CD3+，CD4+和CD4+/CD8+水平均显著高于对照组健康人群，差异具有统计学意义（均P＜0.01）；IE 患者血清Alb 和CD8+水平显著低于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.01）；两组血红蛋白、LVEDD 和LVEF 比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 两组患者生化指标及T 细胞水平表达比较（±s）

表1 两组患者生化指标及T 细胞水平表达比较（±s）

注：WBC：白细胞计数；NEUT：中性粒细胞；Hb：血红蛋白；Alb：清蛋白；hs-CRP：超敏C-反应蛋白；LVEDD：左心室舒张期末内径；LVEF：左心室射血分数。

项 目IE 组（n=53）对照组（n=50）t 值P 值cf-DNA/NETs(μg/L)465.15±146.38135.76±37.5218.0930.000 WBC(×109/L）16.14±5.366.24±1.5311.0360.000 NEUT(%)75.42±10.2562.28±6.457.3520.000 Hb(g/L)138.45±12.51142.56±13.23－1.1430.256 Alb(g/L)35.38±10.7542.15±9.78－4.0390.000 hs-CRP(g/L)39.38±10.752.37±1.0422.9600.000 LVEDD(mm)56.62±12.1855.47±10.250.5220.603 LVEF(%)52.16±5.7253.41±6.39－1.8500.067 CD3+(%)66.23±6.7454.21±5.139.5050.000 CD4+(%)44.35±4.2635.14±3.5210.2980.000 CD8+(%)23.75±3.6826.75±3.66－4.9610.000 CD4+/CD8+1.65±0.431.34±0.335.2890.000

2.2 IE 患者NETs 水平与T 细胞水平表达及预后的相关性分析 根据IE 患者预后情况分为存活组（29例）和死亡组（24 例），死亡组患者cf-DNA/NETs水平为611.46±102.15μg/L，存活组患者cf-DNA/NETs 水平为407.53±76.49μg/L，两组比较差异具有统计学意义（t=7.007，P＜0.01)。Pearson 相关性分析显示：IE 患者血浆cf-DNA/NETs 水平与CD8+水平和死亡呈正相关（r=0.282, 0.352，P=0.041, 0.048），与CD3+，CD4+和CD4+/CD8+呈负相关（r=-0.424，-0.535，-0.32，P=0.002, 0.000,0.016）。

2.3 外周血NETs 水平对预后的价值分析 见图1。以IE 患者入院治疗为研究起点，以患者痊愈出院、死亡或出现严重并发症为研究终点，绘制ROC 曲线。结果显示，外周血NETs 水平对预测IE 死亡有参考意义（P＜0.05）。NETs 预测IE 患者死亡的曲线下面积为0.736（95%CI：0.684～0.829，P＜0.01），预测敏感度、特异度分别为81.29%，75.35%。

3 讨论

感染性心内膜炎（IE）是死亡率高达15%～20%的感染性疾病，其典型生物学特征是赘生物的形成，赘生物主要由大小不等、形状不一的血小板和纤维素团块组成，内含大量病原微生物。赘生物定植于受损的心瓣膜内膜（天然瓣膜IE）或心内假体（假体IE）上，不仅可造成瓣膜周围组织破坏，赘生物脱落还可导致血管栓塞、猝死及心力衰竭等[11]。

图1 外周血NETs 水平预测IE 预后的ROC 曲线

炎症反应是IE 最基础、最关键的病理改变。病原菌的繁殖及内毒素的释放可激发机体白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞的释放以强化对病原菌的吞噬和清除能力[12]。还可以刺激机体产生炎症反应，导致相关炎症指标迅速升高[13]。本研究中IE 组患者WBC，NEUT，hs-CRP 等常规炎症指标水平显著高于对照组。中性粒细胞是宿主防御病原体的第一道防线，能够通过趋化、吞噬、氧化应激、形成NETs 等方式捕获和杀死微生物[14]。NETs是一种由染色质和颗粒肽结合形成的纤维网状结构，NETs 可被真菌、细菌、病毒等多种微生物激活，由中性粒细胞分泌并释放至胞外，从而固定和清除微生物，并激活其他免疫细胞、介导炎症反应[15-16]。目前认为，NET 捕获、黏附病原体主要依赖于三维网状结构，而杀灭病原体依赖于抗菌蛋白[17]。NETs 的形成是由致病菌在全身血液感染中诱导的，既往研究表明，NET 内容物可在组织感染部位含量显著升高。已有研究发现，在IE 患者的脓毒性血栓，检测到NETs[18]。本研究分析IE 患者外周血NETs 水平，结果显示与健康人群相比，IE患者外周血NETs 水平显著升高，证实血浆NETs与感染相关。IE 患者死亡组NETs 水平显著高于存活组，ROC 曲线结果显示，NETs 预测IE 患者死亡的曲线下面积为0.736，结果提示，外周血NETs 水平与IE 患者预后不良密切相关。

免疫功能的改变在IE 患者中有重要作用，CD3+，CD4+，CD8+是重要的 T 淋巴细胞，其中CD3+细胞水平代表机体整体细胞免疫状态[19]，CD4+主要发挥调节免疫应答的功能，通常被称为辅助性 T 淋巴细胞[20]，而CD8+具有抑制免疫功能的作用，可抑制CD4+细胞及B 细胞功能，被称为抑制性 T 淋巴细胞[21]。对IE 患者外周血T 淋巴细胞亚群各个指标进行检测，可较为准确地反映患者当时的免疫状态，本研究结果显示IE 患者CD3+，CD4+和CD4+/CD8+水平均低于对照组，CD8+水平高于对照组（P＜0.05），表明IE 患者存在免疫功能降低。另外，研究发现IE 患者外周血中NETs水平与T 细胞表达水平相关，与CD8+呈正相关（P＜0.05），与CD3+，CD4+和CD4+/CD8+呈负相关（P＜0.05）。这符合NETs 为广义的致病性DNA 复合物的定义，机体的炎症状态与NETs 水平相关。

综上所述，本研究结果表明IE 患者外周血NETs水平显著升高，其水平变化与T 细胞表达水平密切相关，与IE 患者预后不良显著相关。但本研究也有一定的局限性，首先，研究样本量较少，由此可能带来结果的偏倚，还需要大样本、多中心研究以验证本结果的准确性。另外，本研究未剖析IE 患者外周血NETs 水平升高具体机制，这些仍需要进一步研究证实。