Graves病患者血清IL-23，IL-17及Klotho蛋白水平变化及意义

罗 文，罗 钢，周玉玲，胡佩宏，张青林，王莎莎，明 媚

（鄂东医疗集团黄石市中心医院·湖北理工学院附属医院眼科,湖北黄石435000）

Graves 病（Graves disease，GD）是与甲状腺上皮细胞相关的细胞免疫与体液免疫紊乱导致的自身免疫疾病，表现为甲状腺组织淋巴细胞浸润，自身抗体的大量产生[1-2]。GD 发病较为复杂，尚未阐明GD 的发病机制。近年来，大量研究表明T淋巴细胞在此过程中发挥着重要作用，多种细胞因子参与GD 的发生、发展等过程[3]。研究表明，辅助性T 细胞17(T helper cell 17, Th17)作为一种新的CD4+T 细胞亚群，其与GD 的发生与疾病的严重程度相关，而白细胞介素（interleukin，IL）-17 是其产生的一类重要细胞因子[4-5]，白细胞介素（interleukin，IL）-23 能够促进Th17 细胞的增殖，稳定Th17 细胞，预测其与GD 的发病机制密切相关[6]。Klotho 蛋白是一种能够调节磷代谢与维生素D 的重要调控因子，其能够参与GD 的发生、发展[7]。关于IL-23，IL-17 及Klotho 蛋白变化与GD 发病机制的相关性文献报道较少，故本研究主要探究GD患者血清中IL-23，IL-17 及Klotho 蛋白水平的变化，为患者临床治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017年3月～2018年3月于鄂东医疗集团黄石市中心医院就诊的GD 患者50例作为观察组，其中男性27 例，女性23 例，年龄17 ～72（36.98±9.23）岁。纳入标准：①符合GD病的诊断标准[8]；②临床资料完整；③近一个月未使用激素及免疫制剂者；④患者及其家属同意参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：①患有自身免疫疾病者；②患有其他类型甲状腺疾病者或患有甲状腺疾病家族史者；③严重心肾功能不全者；④不配合治疗者。同时选择同期于我院进行健康体检的健康人群50 例作为对照组，其中男性24 例，女性26 例，年龄18 ～73（37.08±8.96）岁。两组性别、年龄等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经过我院伦理委员会审核、批准。

1.2 仪器与试剂 离心机（德国Eppendorf 公司），ELISA 试剂盒（上海浩本生物科技有限公司），免疫电化学发光法（罗氏公司）；

1.3 方法 两组均在清晨空腹状态下采集肘静脉血5 ml，平均分为两份，一份血液4 500 r/min 离心10 min，离心半径10 cm，离心后取上清，利用ELISA 试剂盒检测两组血清中IL-23(批号：20170113)，IL-17(批号：20170304)含量及Klotho蛋白(批号：20170211)的变化，具体操作按照说明书进行。另一份血液采用免疫电化学发光法（批号：1801023）检测患者体内促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、游离甲状腺素（free thyroxine，FT4）、游离三碘甲状腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）和TSH受体抗体（TSH-receptor antibody，TRAb）的含量，并对患者进行24 个月的随访，分析患者IL-17，IL-23 及Klotho 蛋白变化情况以及体内各激素变化情况。患者定期对体内各激素进行检查，随访过程中，一经实验室检查证实患者体内激素超过正常值即停止随访，即患者出现不良预后。

1.4 统计学分析 所有研究数据均在SPSS19.0 软件上运行处理，计量资料用均值±标准差（±s）表示，符合正态分布的数据组间比较采用独立样本t检验，不符合正态分布数据比较采用Mann-Whitney 秩和检验；计数资料用百分数（%）表示，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Pearson相关性分析，诊断价值的评价及诊断临界值的确定采用受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC），并计算曲线下面积。Kaplan-Meier 生存分析不同IL-23，IL-17 和Klotho蛋白水平下GD 患者不良临床转归（出现细菌感染、自身免疫紊乱、诱发关节炎、红斑狼疮等自身免疫疾病）发生率，Log-Rank 检验差异性，采用检验标准设置为P＜0.05，表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清中TSH，FT4，FT3，TRAb 水平及IL-17，IL-23，Klotho 蛋白含量变化 见表1。观察组患者体内FT4，FT3，TRAb 水平及血清中IL-17，IL-23，Klotho 蛋白含量均高于对照组，TSH含量明显低于对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 两组一般资料比较及甲功三项、相关抗体比较（n=50，±s）

表1 两组一般资料比较及甲功三项、相关抗体比较（n=50，±s）

项目观察组对照组tP TSH(mU/L)0.04±0.011.62±0.31-36.0210.000 FT4(pmol/L)68.73±1.87 16.33±2.01134.9640.000 FT3(pmol/L)31.98±1.737.83±0.8688.3900.000 TRAb(U/L)P19.89±1.270.28±0.09108.9110.000 IL-17(pmol/L) 47.83±1.62 26.83±1.0177.7830.000 IL-23(pg/ml)52.98±6.31 10.92±2.0144.9100.000 Klotho(ng/L)8.97±0.126.13±0.1796.5070.000

2.2 GD 组患者IL-17，IL-23 及Klotho 与TSH，FT4，FT3 及TRAb 的相关性 见表2。GD 组患者血清中IL-17，IL-23，Klotho与TSH呈显著负相关（均P＜0.05），与FT3，FT4，TRAb 呈显著正相关（均P＜0.05）。

表2 GD 组患者IL-17，IL-23 及Klotho 与甲状腺功能指标相关性

2.3 ROC 曲线分析 见表3，图1。将GD 组与对照组患者血清IL-23，IL-17 及Klotho 作ROC 曲线，ROC 曲线显示IL-23，IL-17 及Klotho 具有较高的灵敏度与特异度，这些指标对GD 具有一定的诊断

3 讨论

Graves 病（GD）作为一种人体特异性的自身免疫疾病，是甲状腺功能亢进症中常见病症，其发病与细胞免疫、体液免疫紊乱密切相关[9]。长期以来的研究表明，自身免疫疾病的发生与Th1，Th2细胞介导相关，Th17 细胞属于CD4+T 细胞亚群，价值。

表3 IL-23，IL-17，Klotho 蛋白曲线下面积、特异度、灵敏度及cut-off值

图1 IL-23，IL-17，Klotho 水平预测ROC 曲线图

2.4 Kaplan-Meier 生存分析 见表4，图2。Kaplan-Meier 生存分析结果显示高IL-23 水平、高IL-27水平、高Klotho 水平患者不良预后发生率高于低IL-23 水平、低IL-27 水平、低Klotho 水平。该细胞亚群具有独立效应，与Th1 和Th2 细胞在免疫学功能上有较大区别[10]。Th17 细胞主要分泌IL-17，能够参与多种自身免疫疾病发生、发展进程，释放大量的炎症因子，影响机体免疫性抗体的产生[11]。IL-23 只有与受体复合物如IL-23R 结合后才能够发挥促进Th17 细胞分化与Th17 细胞因子产生的作用，在促进自身免疫性疾病进程中发挥重要作用[12]。Klotho 蛋白能够参与人体体内多种生理、生化过程，能够通过抑制Treg，Th17 细胞相关免疫细胞因子水平，降低体内炎症因子的产生，在机体免疫调节过程中发挥作用[13]。

表4 各指标Log-Rank 值

图2 IL-23，IL-17，Klotho 对GD 患者预后影响分析

本研究结果表明，观察组患者血清中IL-17，IL-23 及Klotho 蛋白含量明显高于对照组，且IL-17，IL-23，Klotho 与TSH 呈显著负相关， 与FT3，FT4，TRAb 呈显著正相关。提示IL-17，IL-23 及Klotho 蛋白可能在GD 发病机制中起到一定的作用。白细胞介素是机体中一类重要的细胞因子，能够参与机体中炎症反应、免疫系统调节、促进免疫细胞活化等过程[14-15]。IL-17 蛋白分子量约为3 500 Mr，基因位于人染色体6p12 上，能够表达翻译15 个氨基酸。大量研究表明，一方面IL-17能够通过NF-JB 及P13K/AKT 等途径的调控来增强自身蛋白的表达量，促进多种细胞分泌炎性细胞因子，促进T 细胞的增殖，进而参与多种自身免疫疾病的发生、发展等进程。另一方面，IL-17 还可以作为促炎症因子能够诱导靶细胞，通过增强其他炎症因子如TNF-α，IL-4 等的释放产生趋化因子，加剧趋化白细胞聚集，加剧炎症反应[16]。IL-17 细胞因子在类风湿性关节炎、红斑狼疮、重症肌无力患者体内表达量呈现高表达[17-19]。动物实验表明，过敏性哮喘小鼠体内IL-17 表达量显著增高，并证实IL-17 可能是在急性气道炎症反应过程中引发炎症的主要因素[20-21]。IL-23 是由p40 与p19 两个亚单位组成的异源二聚体，IL-23 需要与IL-12B1，IL-23R 等受体复合物结合后才能发挥作用，IL-23能够增强Th17 细胞及IL-17 细胞因子的表达，在机体抗感染中及促进自身免疫疾病发展过程中起到重要作用。有学者[22]通过敲除Th17 细胞上游IL-23p19 基因，发现IL-23 可能通过调控Th17 细胞释放IL-17 调控GD 病情的发展。王雯等[23]研究结果表明，Klotho 蛋白在GD 患者血清中的含量显著升高，是由于GD 患者体内异常免疫状态引起的反应性升高，起到抗炎等保护性作用。动物实验表明，Klotho 蛋白能够通过抑制体内与Treg 和Th17 细胞相关的免疫细胞因子，Klotho 蛋白还能够抑制宫颈癌荷瘤小鼠体内TGF-β/Foxp3/RORγt 信号通路对Treg 与Th17 细胞进行调节，起到控制疾病进程的作用[24]，我们预测Klotho 蛋白在GD 患者体内也能够起到保护性作用。TSH，FT3，FT4 和TRAb是甲状腺功能指标，是GD 患者确诊的一大依据[25]，TRAb 能够促使甲状腺细胞产生大量的炎性因子IL-17，IL-23，IL-6 等，促进甲状腺自身抗体的生成，从而形成恶性循环，导致疾病不断变化[20]。通过分析IL-23，IL-17 及Klotho 蛋白与甲状腺功能指标之间的相关性，能够进一步说明炎性细胞因子IL-23，IL-17 和Klotho 蛋白与GD 的发生、发展存在一定的相关性，其不仅能够参与甲状腺功能的调控，对于维持甲状腺功能稳定具有重要作用。本研究结果表明IL-23，IL-17 与Klotho 具有较高的灵敏度与特异度，提示其可以作为GD 发病的辅助诊断指标。Kaplan-Meier 生存分析结果显示高IL-23 水平、高IL-27 水平、高Klotho 水平组患者不良预后（出现细菌感染、自身免疫紊乱、诱发关节炎、红斑狼疮等自身免疫疾病）发生率高于低IL-23 水平、低IL-27 水平、低Klotho 水平，提示IL-23，IL-17 及Klotho 蛋白对于GD 患者预后具有一定的指导意义。综上所述，IL-17，IL-23，Klotho 蛋白在GD患者体内表达量含量升高，预测三者可能参与GD的发生、发展等过程，可以作为GD 的诊断、治疗的重要指标，为临床GD 的治疗提供新的方向。