耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌感染的临床特征及耐药机制研究

郑 茂，陈宗耀，王登朝，邹 玉

（德阳市人民医院a. 检验科；b. 输血科，四川德阳 618000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一种临床常见的条件致病菌，可定植于人体皮肤、黏膜、肠道等部位，常引起肺部感染、尿路感染、血流感染等多种疾病，严重者可危及生命[1]。碳青霉烯类抗生素抗菌谱广、抗菌活性强，是目前临床治疗产超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum β-lactamase，ESBLs）、头孢菌素酶（cephalosporinase）等多重耐药菌引起严重感染的一线用药，由于抗生素选择压力，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CR-KP） 检出率呈逐年上升态势，给临床抗感染治疗带来巨大挑战[2]。近年来，汇聚高毒力和高耐药的“超级细菌”-耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌（carbpenem-resistant hypervirulentKlebsiella pneumoniae，CR-hvKP）的出现，并导致多次严重医院内感染事件，更是引起全球公共卫生的高度关注[3-4]。全国细菌耐药监测网的数据显示[5]，肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南的耐药率从2014年的4.8%，4.5%，快速上升至2019年的10.5%，10.9%，耐药形势十分严峻。本研究旨在分析CR-KP 感染的临床特征及耐药机制，以期为临床合理使用抗生素提供参考，更好地防治CR-KP 感染。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2016年1月～2020年12月从德阳市人民医院住院患者各类临床标本中分离的CR-KP。菌株入选标准：①符合美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S30 关于CR-KP 的判定标准，即肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南或厄他培南任何一种抗生素耐药；②同一患者首次分离株。排除标准：①患者临床资料缺失；②同一患者重复分离株；③菌株未能妥善保存。CR-KP 感染患者男性61 例，女性28 例，中位年龄60 岁（26 天～93 岁），回顾性调查患者的临床资料，包括住院号、姓名、性别、年龄、科室、标本类型、基础疾病、侵入性操作、菌株检出前2 周抗生素使用情况、是否并发其他细菌感染等。本研究经过医院伦理委员会批准（批件号2020-04-016）。

1.2 仪器与试剂 基质辅助激光解析电离飞行时间（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）质谱仪（德国布鲁克公司），VITEK2 Compact 微生物鉴定系统（法国生物梅里埃公司），ABI7500 实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）。细菌药敏测试卡、E-test药敏纸条（法国生物梅里埃公司），琼脂平板（郑州安图生物公司），细菌基因组DNA 提取试剂盒、Talent qPCR PreMix（北京天根公司）。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603（卫生部临床检验中心）。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离及药敏试验：按照《全国临床检验操作规程（第4 版）》要求进行细菌分离培养，使用MALDI-TOF-MS 进行菌株鉴定、VITEK2 Compact 进行药敏试验，头孢他啶-阿维巴坦采用纸片扩散法（Kirby-Bauer，K-B）作为补充药敏试验，依据CLSI M100-S30 标准判定药敏结果。所有CR-KP 均采用E-test 法对亚胺培南、美罗培南的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）进行复核，确认药敏为碳青霉烯类耐药。

1.3.2 碳青霉烯酶基因及毒力基因检测：复苏菌株接种于血琼脂平板，37℃培养16 ～20 h，次日分离出单个菌落，按照试剂盒说明书提取CR-KP 基因组DNA，参照文献[6]设计引物，由上海生工公司合成，引物序列见表1。使用SYBR Green 染料法进行实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测常见碳青霉烯酶基因（blaKPC，blaNDM，blaIMP，blaVIM，blaOXA-48）和毒力基因（aerobaction）。PCR 反应体系：Talent qPCR PreMix 10 μl，正反向引物（10 μmol/L）各0.6 μl，cDNA 2 μl，RNase-free ddH2O 6.8 μl。反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性5 s，60℃退火10 s，72℃延伸32 s，40 个循环。待PCR扩增反应结束后，调整反应基线至适宜处，以Ct＜35判定基因为阳性表达。

1.3.3 CR-KP 高黏性表型判断：将CR-KP 接种于血琼脂平板，37℃培养16 ～20 h，用接种环轻柔向上挑起单个菌落，重复2 次，若挑起的黏液丝长度≥5 mm，即拉丝试验阳性，称菌株为高黏性表型。1.3.4 CR-KP 高毒力株筛选：参照文献[7-8]将毒力基因（aerobactin）和拉丝试验同时阳性，作为判断高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae，hvKP）的标志，从CR-KP 中筛选出高毒力株，即CR-hvKP。

表1 real-time PCR 引物序列表

1.4 统计学分析 采用SPSS22.0 软件进行数据分析、WHONTE5.6 软件进行药敏分析。计数资料以例数或构成比表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，危险因素采用logistic 回归分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CR-KP 检出变化趋势 2016 ～2020年总计分离出2 562 株肺炎克雷伯菌，其中89 株CR-KP 占比3.47%。历年检出的CR-KP 株数分别为7，13，22，17 和30，在肺炎克雷伯菌中占比分别为1.59%，2.64%，3.58%，3.78%和4.87%，总体上呈逐年上升趋势。

2.2 CR-KP 来源科室及标本类型分布 见表2。CRKP 主要来源于ICU（17.98%，16/89）、感染科（14.61%，13/89）、肿瘤科（14.61%，13/89）；标本类型主要为痰液（50.56%，45/89）、尿液（15.73%，14/89）、脓液（12.36%，11/89）。

表2 CR-KP 来源科室及标本类型分布（n=89）

2.3 CR-KP 对常用抗生素的药敏情况 见表3。CR-KP 对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、单环类等抗生素普遍耐药，耐药率均＞70%。CR-KP 对氨基糖苷类阿米卡星、庆大霉素耐药率相对较低，分别为28.54%，39.33%。CR-KP 对新型β 内酰胺类复合制剂头孢他啶-阿维巴坦和脂肽类黏菌素耐药率低，分别为14.61%，7.87%。

2.4 CR-KP 碳青霉烯酶基因携带情况 总计有70株CR-KP 检出碳青霉烯酶基因阳性表达，检出率为78.65%（70/89），包括56 株携带blaKPC，10 株携带blaNDM，3 株携带blaIMP和2 株携带blaVIM，其中1 株同时携带blaKPC和blaNDM。本研究未检出blaOXA-48阳性表达。

表3 CR-KP 对常用抗生素的药敏情况 [n (%)]

2.5 CR-KP 中高毒力株检出情况及感染危险因素比较 见表4。从CR-KP 中筛选出16 株CR-hvKP（17.98%，16/89），将CR-KP 感染患者分为高毒力株感染组（CR-hvKP 组）和非高毒力株感染组（CR-cKP 组）。单因素分析表明，年龄≥60岁、糖尿病、肝胆疾病、机械通气、留置导管、入住ICU 等共6 个因素，在CR-hvKP 组和CRcKP 组之间的差异均有统计学意义（χ2或Fisher=4.973 ～19.377，均P＜0.05）。

表4 CR-hvKP 组和CR-cKP 组的危险因素比较 [n (%)]

2.6 CR-hvKP 感染的多因素logistic 回归分析 见表5。将2.5 中差异有统计学意义的6 个变量进一步纳入多因素logistic 回归分析，结果显示在CRKP 感染患者中，糖尿病（OR=10.947，95%CI：1.751 ～68.424，P=0.010）、入住ICU（OR=16.012，95%CI：2.589 ～99.036，P=0.003）是CR-hvKP 感染的独立危险因素。

表5 CR-hvKP 感染的多因素logistic 回归分析

3 讨论

肺炎克雷伯菌是中国临床分离率常居第二位的革兰阴性菌，也是医院内感染的重要病原菌，其耐药日益严重，尤其是CR-KP 感染不断涌现，使得临床治疗面临巨大困境[9]。研究显示患者感染CR-KP后通常造成治疗失败、住院时间延长、死亡率升高等，特别是与血流感染、入住ICU 或接受器官移植相关的死亡率明显升高[10]。因此，CR-KP 长期以来都是医院内细菌耐药监测的重点。

本研究中CR-KP 在肺炎克雷伯菌中占比呈逐年上升趋势，2020年达到4.87%，纵然该数据尚低于全国水平（10.9%），但仍明显高于许多省份，如山西、广西、海南等[9]，故需高度警惕肺炎克雷伯菌的泛耐药传播。CR-KP 首要来源于ICU，这与诸多因素有关。ICU 患者常具有多种基础疾病、免疫力低下、住院时间长，加之大量广谱抗生素的使用，更是增加了CR-KP 感染的机会。LI 等[11]报道的一项长达4年追踪研究证实，通过综合的感染预防及控制措施，可以使ICU 获得性CR-KP 定植或感染显著减少。因此，加强对重症患者的病原微生物送检，能尽早发现CR-KP 感染并进行相应治疗，降低并发症发生。另外，儿科检出的CR-KP 占比高达13.48%，且在新生儿中更常见，但婴幼儿生长发育尚不完善，药物使用禁忌多，造成可选的抗生素种类极少。邓文喻等[12]报道2015 ～2018年广东省某妇幼保健院婴幼儿呼吸道感染分离的肺炎克雷伯菌，对亚胺培南的耐药率从4.35%上升至19.15%，增长趋势十分明显，这说明减少儿科患者的广谱抗生素使用率已十分必要，或有助于降低其分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类的耐药性。

本研究发现CR-KP 对氨基糖苷类耐药率相对较低，对头孢他啶-阿维巴坦、黏菌素耐药率则更低。临床治疗CR-KP 感染时，可经验性优选庆大霉素、阿米卡星、头孢他啶-阿维巴坦等药物，或根据药敏结果合理选用抗生素。SHIELDS 等[13]报道对于CR-KP 引起的菌血症，氨基糖苷类尤其是庆大霉素，具有不错的抗菌效果。然而，由于氨基糖苷类具有较明显的耳毒性、肾毒性等不良反应，儿科患者应用受限。尽管CR-KP 对黏菌素耐药率低，但临床和PK-PD 数据证实黏菌素临床疗效有限，其应与一个或多个其他抗生素联合使用。食品药品监督管理局（food and drug administration, FDA）于2015年批准头孢他啶-阿维巴坦用于治疗泌尿系统和腹腔感染革兰阴性杆菌的患者，CLSI M100 亦给出其参考折点，这为多重耐药菌感染提供了治疗依据。体外研究证实头孢他啶-阿维巴坦对携带blaKPC的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE）具有较强抗菌活性，对携带blaNDM，blaIMP的CRE 抗菌活性较弱[14]。另外，对头孢他啶、美罗培南和黏菌素耐药，以及对多种药物联合应用也耐药的肠杆菌，头孢他啶-阿维巴坦仍然具有高度的抗菌活性[15]。周琴等[16]对120株CR-KP 进行抗菌分析证实头孢他啶-阿维巴坦的耐药率仅为16.67%，与本研究结果接近。由此可见，头孢他啶-阿维巴坦有望成为将来治疗CR-KP 感染的一线用药。

碳青霉烯酶按照Ambler 分类法则，可分为A，B，D 三类。A 类为丝氨酸碳青霉烯酶，编码基因包括blaKPC，blaSME等，以blaKPC流行最常见、分布最广泛；B 类为金属β-内酰胺酶，编码基因包括blaNDM，blaIMP，blaVIM等，其中blaNDM自2009年印度首次发现后，现已在全球广泛播散；D 类为苯唑西林酶，对碳青霉烯酶水解活性较低，编码基因主要有blaOXA-48[17]。本研究中超过3/4 的CR-KP 检出碳青霉烯酶基因阳性，主要为blaKPC，blaNDM，表明KPC 酶、NDM 酶是该院CR-KP 所流行的主要碳青霉烯酶，这与ZHANG 等[18-19]报道的全国调查数据一致。虽然KPC 酶是CR-KP 最常见的碳青霉烯酶，所幸该类酶仍然可以被多种新型复合制剂所抑制，包括亚胺培南-瑞来巴坦、美罗培南-维博巴坦和头孢他啶-阿维巴坦等[20]。

hvKP 是肺炎克雷伯菌的新变种，携带多种毒力基因，致病力强，能引起肝脓肿、眼内炎、脑膜炎等侵袭性感染，其在平板上生长菌落常呈高黏液性，可通过拉丝试验验证，但目前仍缺乏有效的表型确证试验[21]。铁载体是细菌在宿主体内生长繁殖不可或缺的条件，RUSSO 等[22-23]报道aerobaction是hvKP 最重要的铁载体，也是介导毒力的关键因子。既往研究常将携带aerobaction 基因的肺炎克雷伯菌定义为hvKP[7,24]，故本研究以aerobactin 基因和拉丝试验同时阳性，从CR-KP 中筛选出CRhvKP。以往多重耐药菌几乎都不是高毒力，但CRhvKP 兼具高毒力和高耐药表型，俨然是一种“超级细菌”，对于重症患者而言很可能是致命的。研究显示CR-hvKP 感染临床治愈率低，传播性强，明确相关危险因素是做好预防控制措施的关键[25]。本研究发现在CR-KP 感染患者中，糖尿病、入住ICU 是CR-hvKP 感染的重要危险因素。中性粒细胞胞外捕获网（NETs）能够以非共价形式结合多种抗菌成分，捕获和杀灭病原微生物，是hvKP 主要的抗菌防御机制。JIN 等[26]报道糖尿病患者的NETs 结构表面存在损伤，而这种NETs 杀菌缺陷很可能是导致糖尿病患者易感CR-hvKP 的机制。ICU患者大都病情较重，接受侵入性操作多，这无疑增加了感染的机会，故CR-hvKP 引起的严重院内感染也常集中发生在ICU[3-4,27]。CR-hvKP 感染并非无药可用，YU 等[28]报道头孢他啶-阿维巴坦对其依然具有较强抗菌活性（MIC90 ≤1 μg/ml），这可能是治疗CR-hvKP 感染的理想选择。

综上所述，细菌耐药已成为威胁公共卫生的世界性难题，尤以CR-KP 呈全球流行趋势颇为严峻。当前形势下，多模式、多学科的感染控制策略，规范化抗感染治疗，严格的抗菌药物管理，对遏制CR-KP 的传播至关重要。