妊娠期糖尿病患者血清miR-450a-5p和CREB表达水平及临床意义

周 青，秦智娟，马宗丽

（如皋市人民医院妇产科，江苏南通 226500）

在妊娠期间首次发生不同程度的异常糖耐量病症被称为妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)，每年发病率约为1%～15%，且有逐年升高的趋势[1]。GDM 对母婴均会产生不良的影响，严重者甚至会造成远期并发症，这不仅降低了母婴的生命健康和生活质量，还给社会带来了巨大的医疗负担。随着生育政策的放开，高龄孕妇不断增加，预计妊娠期糖尿病发病率会进一步上升[2]。现目前，GDM 的发病机制尚未明确，因此，寻找敏感度、特异度高的生物标志物对GDM 的有效靶向治疗具有重要意义。

环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(c-AMP response elementbinding protein，CREB)在细胞内参与多种信号的转导，可调控多种基因的表达，在中枢神经系统中的作用尤为明显，神经网络的构成效果受蛋白磷酸化水平的波动影响[3]。一些研究已将CREB视为不同肿瘤类型中的推定致癌信号，尤其是在白血病和神经胶质瘤中。微小核糖核酸（mircro RNAs，miRNAs）通过与mRNA 非编码区域特异性相结合而调控多种分子生物学过程[4]。miR-450a-5p 为近年来新发现的miRNA 分子。有研究人员[5]指出，CREB 与miR-450a-5p 之间存在结合位点，发现上调的miR-450a-5p 通过靶向CREB 可以消除甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）对胰岛素的抵抗。因此，miR-450a-5p，CREB 可能是改善GDM 诱导胰岛素抵抗的潜在治疗靶点。本研究旨在探讨血清miR-450a-5p，CREB 在GDM 患者中的表达水平及临床意义，为进一步明晰GDM的复杂机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年4月～2020年4月在如皋市人民医院妇产科建档产检的120 例GDM 孕妇为GDM组，选择同期的120例健康孕妇为对照组。妊娠期糖尿病组年龄22 ～39（29.57±4.13）岁；孕周24～29（28.50±1.60）周，孕次1～4（2.23±0.41）次，产次0～3（1.46±0.35）次；对照组年龄22～39（28.98±3.85）岁；孕周24 ～29(28.40±1.56)周，孕次1～4（2.29±0.44）次，产次0～3（1.48±0.39）次，两组基线资料比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。纳入标准：① GDM 组首次确诊为GDM[6]；② 在本院进行定期产检；③ 孕周≥24 周。排除标准：① 多胎妊娠；② 患有高血压、高血脂等其他妊娠并发症；③ 孕前患糖尿病或糖尿病家族史。本研究已经过患者及家属知情并签字，且经本院道德伦理委员会批准通过，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 仪器与试剂 低温高速离心机M16RS（上海迈皋科学仪器有限公司）；Trizol 试剂[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；RNA 逆转录试剂盒(北京天根生化有限公司)；miScript SYBR®Green qPCR Kit( 德国QIAGEN 公司)；qRT-PCR 仪( 美国Bio-Rad 公司)；人cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）ELISA 试剂盒(北京全式金生物公司)，酶标仪(上海众磊生物公司)；-80℃超低温冰箱（美国Thermo 公司）；移液枪（德国Eppendorf 公司）；引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。

1.3 方法

1.3.1 采集样本：患者入组后的次日清晨采集空腹静脉血5ml，在3 000r/min 条件下离心l0min，取其上清液于EP 管内，于-20℃保存，待测。

1.3.2 观察指标：①胰岛素抵抗相关指标：检测空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）及空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）（全自动电化学发光分析仪分析），计算稳态模型胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-Insulin resistance，HOMA-IR)=(FPG×FINS)/22.5。②临床参数指标：年龄、身体质量指数（body mass index，BMI）。

1.3.3 qRT-PCR 检测血清中miR-450a-5p 相对表达水平：在两组患者血清中加入Trizol 试剂进行总RNA 提取，采用超微量分光光度计计算RNA 纯度，符合实验标准的吸光度A280nm参考范围为0.0 ～2.0。采用RNA 逆转录试剂盒反转录为cDNA。参照miScript SYBR®Green qPCR Kit 试剂盒说明书进行qRT-PCR 反应，PCR 反应条件：95 ℃3min，95℃10s，58℃30s，72℃10s，42 个循环，以U6为内参，采用2-ΔΔCt计算血清中miR-450a-5p 相对表达水平，见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.4 ELISA 检测血清中CREB 表达水平：应用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定已分离保存的血清CREB 水平，试验过程严格按照说明书上的步骤操作，应用酶标仪在A450nm处读各孔的吸光度值(A值)，绘制标准曲线，得出其浓度。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验。Pearson 相关性分析血清miR-450a-5p，CREB 与GDM 患者临床病理特征的关系；采用受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线分析miR-450a-5p，CREB 表达水平在GDM 疾病中的诊断价值；Logistic 回归分析GDM 发生的影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床参数和胰岛素相关指标水平比较 见表2。GDM 组孕产妇BMI，FBG，FINS 及HOMA-IR 指标水平均高于对照组，其差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 两组临床参数和胰岛素相关指标水平比较(±s)

表2 两组临床参数和胰岛素相关指标水平比较(±s)

项 目GDM 组（n=120）对照组（n=120）tP年龄（岁）29.57±4.1328.98±3.851.1450.253 BMI（kg/m2）27.12±4.9325.05±4.283.4730.001 FBG（mmol/L）8.05±0.785.58±0.5129.0340.000 FINS（mIU/L）13.92±1.898.35±1.9322.5880.000 HOMA-IR5.02±2.132.42±1.0511.9940.000

2.2 血清miR-450a-5p 和CREB 在两组中的表达水平 血清miR-450a-5p 在GDM 组中表达水平（0.69±0.15）均明显低于对照组（1.58±0.34），差异具有统计学意义（t=26.235，P＜0.05），血清CREB 在GDM 组中表达水平（8.75±2.42μg/ml）均明显高于对照组（2.64±0.66μg/ml），差异具有统计学意义（t=26.683，P＜0.05）。

2.3 miR-450a-5p，CREB 表达水平与GDM 患者临床指标的相关性分析 见表3。血清miR-450a-5p 水平与FBG，HOMA-IR 呈显著负相关（r=-0.427，-0.251），与FINS 呈显著正相关（r=0.636）；CREB 水平与FBG，HOMA-IR 呈显著正相关（r=0.432，0.574），与FINS呈显著负相关（r=-0.573），差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 miR-450a-5p，CREB 表达水平与GDM 患者临床指标的相关性分析

2.4 血清中miR-450a-5p，CREB 表达水平对GDM的诊断价值 见表4，图1。ROC 曲线分析血清miR-450a-5p，CREB 水平对GDM 的诊断价值结果表明，二者的曲线下面积（AUC）分别为0.926，0.881；截断值分别为0.952，3.888μg/ml；敏感度分别为91.7%，86.7%；特异度分别为90.8%，89.2%。

表4 血清中miR-450a-5p，CREB 表达水平对GDM 的诊断价值

图1 血清中miR-450a-5p，CREB 表达水平对GDM 的诊断价值

2.5 Logistic 回归分析GDM 发生的影响因素 见表5。以单因素分析中差异具有统计学意义的BMI，FBG，FINS，HOMA-IR，miR-450a-5p 和CREB 为自变量，以GDM 是否发生为因变量，经Logistic 回归分析结果显示，血清miR-450a-5p 是GDM 的保护因素，血清CREB 是GDM 的独立危险因素（P＜0.05）。

表5 GDM 患者血清中miR-450a-5p，CREB Logistic回归分析

3 讨论

妊娠期糖尿病（GDM）为妊娠期常见并发症，患有GDM 的孕产妇常常出现酮症酸中毒、代谢功能紊乱及围生期并发症等，随着病症的加重，母婴的死亡率也随之增加[7]。有研究表示，约有50%的GDM 患者在妊娠之后会出现2 型糖尿病，且GDM不仅会对孕妇及腹中胎儿的身体健康造成影响，对胎儿成年后各种代谢性疾病的发生率也有一定影响[8]，对孕妇生活质量及新生儿的身体健康均造成了严重的威胁。因此，早期诊断和预防对改善GDM妊娠结局意义重大。

糖尿病是一种胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗而引起的代谢疾病。miRNA通过与靶基因mRNA 的3’端非翻译区特异性结合而调控靶基因的转录，进而参与多种生理病理过程，如参与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学进程，其作为新靶点在早期诊断和治疗癌症的过程中有重要的意义[9]。ZHAO等[10]研究发现，miR-450a-5p 在胃癌细胞中呈低表达，通过靶向CREB1 从而抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡，miR-450a-5p 可能是治疗胃癌的新分子靶点。LIU 等[11]试验表明miR-450a-5p 在胶质瘤组织中呈低表达，且与吉非替尼协同抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。最近的一项研究[12]发现，miRNAs 通过调节胰岛素的合成、分泌和信号转导在糖尿病发病机制中发挥重要作用。WEI 等[5]研究表明，miR-450a-5p 的表达在高糖状态的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中呈下调趋势，并且随着MGO 浓度的增加而降低。因此，可以推测miR-450a-5p 可能参与了糖酵解过程并在糖尿病的发病机制中发挥作用。与本研究相结合发现，GDM组患者血清中miR-450a-5p 表达水平较对照组显著下调，且血清miR-450a-5p 水平与FBG，HOMA-IR呈负相关，与FINS 呈正相关，提示miR-450a-5p 可能参与了GDM 的发生发展过程；进一步ROC 曲线分析结果显示，血清miR-450a-5p 水平对GDM 诊断的曲线下面积为0.926（敏感度和特异度分别为91.7%，90.8%），提示miR-450a-5p 对GDM 的早期诊断具有较高的效能。Logistic 回归分析显示miR-450a-5p 是GDM 的保护因素，提示miR-450a-5p 有望成为GDM 诊断及预后评估的潜在生物学指标。推测miR-450a-5p 在GDM 中可能是通过调节胰岛素分泌相关基因的表达，从而控制GDM 的发生。

环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)作为一种核转录蛋白，能改变短时程记忆，与长时程记忆的形成及活化有密切的关系。记忆相关因子随着CREB 的激活而转录，从而产生多种与学习记忆相关蛋白[13]。以往的研究主要集中在CREB 与神经系统的关系[14]。近年来，研究发现糖尿病状态下，胰岛素信号通路活性通常属于下调状态，尤其是下游Akt 的信号通路，因此认为改善糖尿病认知功能障碍可以通过调节Akt/CREB 信号通路的活性来实现[15]。BENCHOULA 等[16]指出，CREB 被胰高血糖素和许多其他导致糖尿病患者空腹血糖水平升高的因素过度激活，且CREB 核转录活性作为治疗糖尿病和糖尿病并发症的靶向因子，在糖尿病和糖尿病并发症中起着至关重要的作用。在本研究中，与对照组相比，血清CREB 表达水平显著上调，且其水平与FBG，HOMA-IR 呈正相关，与FINS 呈负相关，提示CREB 可能是GDM 患者妊娠过程中调节胰岛素敏感性的重要因子之一，其可为GDM 的诊断提供参考依据；ROC 曲线显示，血清CREB水平对GDM 诊断的曲线下面积为0.881（敏感度和特异度分别为86.7%，89.2%），提示CREB 具有作为GDM 患者血清标志物的潜能，当截断值大于3.888μg/ml 时孕产妇有发生GDM 的风险；Logistic回归分析显示血清CREB 是GDM 的独立危险因素，提示当CREB 呈高表达时应加强对患者的指标监控及干预治疗。推测CREB 在GDM 中的作用可能是因为miR-450a-5p 在肝脏中激活其靶基因CREB 时可促进肝脏胰岛素抵抗，从而打破机体葡萄糖平衡，最终导致GDM 的发生。

综上所述，miR-450a-5p，CREB 在GDM 患者血清中呈异常表达，二者可作为GDM 早期诊断及预后评估的潜在生物学指标，为临床GDM 的治疗提供新的思路。本研究的不足之处在于样本数量较少，后期应扩大样本量证实本研究结果的可靠性，为GDM 的具体机制研究提供数据依据。