人非小细胞肺癌组织中转录因子E2F家族表达与临床病理特征及预后的相关性分析

张涛元，丁雪梅，李 俏，祝撷英，曹三成，吴 爽

（1.青岛大学附属日照医院/日照心脏病医院，山东日照 276801；2.日照市中医医院，山东日照 276899；3.西安交通大学附属儿童医院，西安 710003）

肺癌是世界范围内严重威胁人类健康的癌症[1]之一，根据其组织学类型分为两类：小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。其中NSCLC 约占肺癌的85%，又分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌三类[2]。随着对NSCLC 发病机制的深入研究，NSCLC 的诊断和治疗手段提升较大，然而NSCLC 的5年总生存率(overall survival，OS)仍小于15%[3]。因此亟需寻找更多有效的生物标志物，用于预测NSCLC 的病理过程并作为潜在药物靶点，改善预后和实施个体化治疗。

迄今为止，转录因子E2F 家族共发现了8 个因子，并按其发现顺序进行编号（E2F1, E2F2, E2F3,E2F4, E2F5, E2F6, E2F7, E2F8）。有研究报道，E2F1, E2F2, E2F3, E2F8 与肺癌的发生密切相关[4-7]，然而E2F 家族在NSCLC 中的表达、与临床病理相关性和可能的作用机制仍未见报道。

近些年，微阵列技术和生物信息技术已被广泛用于鉴定基因组表达水平的改变，帮助我们识别癌症相关的差异表达基因和相关信号通路。本研究利用生物信息学技术，分析E2F 家族在NSCLC 中的表达情况，探究其与NSCLC 分期、淋巴转移、患者预后之间的相关性，并聚焦其在NSCLC 中的基因突变情况，寻找致病机理，为NSCLC 的诊断提供新型标志物。

1 材料与方法

1.1 数据来源 通过在线数据库获取所需的非小细胞肺癌的临床病例数据，并对所有病例中E2F 家族的相关数据进行统计分析。

1.2 方法

1.2.1 E2F 家族在转录水平表达差异的验证: 利用Oncomine 数据库（www.oncomine.org）[8]，比较E2F 家族在癌组织与正常组织中转录水平表达差异，同时获取肺癌组织与正常肺组织中E2F 家族的研究数据，参数设置如下：t-检验，P-Vaule 为0.01,Fold Change 为1.5, Gene Rank 为10%, Date Type 为mRNA。利用UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu)数据库[9]，验证NSCLC 患者E2F 家族mRNA 的表达情况。

1.2.2 E2F 家族与NSCLC 患者临床病理参数的分析:利用UALCAN 数据库，分析E2F 家族的mRNA 表达情况与NSCLC 患者的癌症分期和淋巴转移之间的相关性，t-检验进行数据处理，且P＜0.05 时差异具有统计学意义。

1.2.3 E2F 家族与NSCLC 患者总生存率的分析: 利用 Kaplan Meier-Plotter(http://kmplot.com/analysis/)网站，分析E2F 家族与NSCLC 患者总生存期之间的相关性。将NSCLC 患者分为高表达和低表达2组，分组标准为E2F 家族mRNA 表达值的中位数，计算危险比(hazard ratio,HR)、95%置信区间(95%confidence interval, 95%CI)和P值，制作生存曲线。

1.2.4 E2F 家族在NSCLC 患者基因组图谱中的分析: 利用cBioPorta 数据库，对E2F 家族在NSCLC患者基因组图谱中的变化进行分析，共纳入标本1 380 例，分析内容包括突变、预测的GISTIC 拷贝数改变(CNA)、mRNA 表达的z评分(RNA-Seq V2 RSEM)和蛋白表达z 评分(RPPA)。

1.3 统计学分析 E2F 家族在转录水平表达差异的验证及E2F 家族与NSCLC 患者临床病理参数的分析，采用t检验进行数据处理，且P＜0.05 时差异具有统计学意义；E2F 家族与NSCLC 患者总生存率的分析，计算危险比(HR)、95%置信区间和P值，且P＜0.05 时差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC 患者中E2F 家族在mRNA 水平高表达Oncomine 数据库显示，E2F 家族的mRNA 在肺癌患者中均呈现高表达，见图1。UALCAN 数据库中，对NSCLC 患者E2F 家族的转录水平进行验证（其中正常对照组59 例，癌症组519 例），结果显示，与正常肺组织相比，E2F 家族成员在NSCLC 组织中mRNA 均高表达，且差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图1 Oncomine 数据库中E2F 家族在所有肿瘤与正常组织中的mRNA 表达差异

2.2 E2F 家族转录水平高表达与NSCLC 患者的癌症分期、淋巴转移密切相关 见表2。利用UALCAN 数据库对E2F 家族进行NSCLC 患者临床病理参数相关性分析，结果显示在癌症分期（其中正常对照59 例，stage1 患者277 例，stage2 患者155 例，stage3 患者85 例，stage4 患者28 例）中，随着癌症分期的增加，E2F 家族的mRNA 水平逐渐升高；在淋巴转移中（正常对照59 例，N0 患者331 例，N1 患者96 例，N2 患者74 例，N3 患者2 例），随着淋巴的扩散范围的增大，E2F 家族的mRNA 水平显著上升。

表1 UALCAN 数据库中E2F 家族在NSCLC组织与正常肺组织中的mRNA 表达差异

2.3 E2F 家族与NSCLC 患者总生存率密切相关 见图2。利用Kaplan Meier-Plotter 进行E2F 家族与NSCLC 患者预后的相关分析，并绘制生存曲线图，结果显示，E2F1, E2F2, E2F4, E2F7, E2F8 的高表达组，NSCLC 患者总生存率显著低于低表达组。

2.4 E2F 家族在NSCLC 患者基因突变的分析 见图3。在1 380 例NSCLC 标本中，共有435 例标本的E2F 家族基因发生了包括突变、CAN，RNA-Seq V2 RSEM，RPPA 在内的改变，比例高达31.52%。

3 讨论

E2F 转录因子在包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌等在内的多种癌症中高表达[13-15]，在肿瘤的进程中起着重要作用。尽管一些研究已经证实部分E2F 家族成员在NSCLC 中发挥关键作用，但是关于E2F家族在NSCLC 中的生物学分析仍未见报道。本研究首次探讨不同E2F 因子在NSCLC 中mRNA 表达和预后价值，为寻找NSCLC 的诊断提供新的思路。

表2 E2F 家族在NSCLC 患者的不同癌症分期、淋巴转移级别中的转录水平表达差异

图2 E2F 家族在NSCLC 患者中总生存率的生存曲线

针对NSCLC，E2F 家族中研究最多的因子为E2F1。E2F1 的过表达与NSCLC 的发生相关，且干扰pRb-p53-MDM2 能增强E2F1 在NSCLC 中的促癌作用[16]。另有研究发现，在小细胞肺癌中，E2F1 能够通过ZEB1 促进肿瘤的侵袭[16]。本研究通过数据分析发现，E2F1 在NSCLC 中高表达，且随着肿瘤的进展及转移，E2F1 的表达量也随之增高，提示E2F1 可作为监测NSCLC 病情进展的肿瘤标志物。

图3 NSCLC 患者中E2F 家族基因表达及基因突变分析

据报道，E2F2 是NSCLC 的肿瘤激活因子，是NSCLC 患者OS 的独立生存指标[17]。同时，在血液组织中检测E2F3 表达情况，发现肺癌患者血液中E2F3 的mRNA 水平显著高于正常人血液，即lncRNA NEAT1 能够上调E2F3，从而促进肺癌的发生，提示E2F3 可以作为肺癌诊断的敏感指标[18]。最新研究发现，E2F3 与NSCLC 的转移密切相关，预示着E2F3 在NSCLC 的预后诊断中具有一定的价值[19]。

E2F4 作为抑制转录因子，能够抑制增殖，并介导辣椒素的抗增殖活性[20]。BANKOVIC 等[21]人通过DNA 指纹图谱研究了NSCLC 患者基因组的不稳定性，发现E2F4 是参与其生长和转移的基因之一。在本研究中，E2F4 高表达与NSCLC 的肿瘤分级、淋巴转移及患者较差的OS 相关，这似乎与E2F4 作为肿瘤抑制因子的作用不一致，需要后续的验证试验加以证明。

E2F5 在前列腺癌和胶质母细胞瘤中高表达[22-23]，但是在NSCLC 中未见报道。本研究证实E2F5 在NSCLC 中mRNA 高表达，临床病理数据显示E2F5 与癌症分级相关，但与患者OS 无明显相关性。

有研究证实，miR-424 负调控E2F6 的表达，抑制A549 细胞的增殖和侵袭[24]。在NSCLC 患者血液中，检测E2F6 的表达，显示其mRNA 较正常人血液样本高表达[21]，而E2F6 与NSCLC 的患者生存情况相关性目前未见报道。

E2F7，E2F8 被证明是肿瘤激活因子，E2F8能阻断其他E2F 家族成员与cyclin D1 的结合，并激活cyclin D1[25]；芯片测序分析表明，E2F8 能够与uhrf1 的启动子结合，参与其激活与调控[26]。通过生物信息学，我们发现随着NSCLC 的发生发展，E2F7，E2F8 的mRNA 水平也随之升高，且E2F7，E2F8 的高表达，与患者较差的OS 相关，预示着E2F7, E2F8 有可能作为NSCLC 的发展及预后的标志物，指导临床治疗。

通过系统分析，我们发现E2F 家族的表达与NSCLC 的发生、发展及预后密切相关，同时通过对E2F 家族突变分析，发现其在NSCLC 患者中突变率高达31.52%，提示E2F 家族的突变可能与NSCLC 的发生存在密切关系，预示着有可能通过E2F 家族突变检测提示NSCLC 的发生风险；同时，鉴于E2F 家族特别是其中的E2F1, E2F2, E2F3,E2F5, E2F7 和F2F8 与NSCLC 患者肿瘤分级及淋巴转移密切关系，提示他们可作为肿瘤发展、转移等病情监测手段；而E2F4, E2F7 和E2F8 与较差的OS 的相关性，提示他们可作为患者较差预后的检测标志物。

综上所述，本文系统地分析了E2F 家族在NSCLC 中的表达和预后价值，并对E2F 家族及相关蛋白可能参与的NSCLC 中的生物学功能进行了深入研究。但是，由于本文是基于公共数据库对已公开数据进行统计分析，因此缺乏相关的分子生物学实验验证，因此具有一定局限性，后续研究将根据本实验结果补充验证试验。