miR-505-3p对胃癌细胞增殖、克隆形成及迁移、侵袭的影响及机制研究

张金刚，齐普良，吴 刚，郭厚乐，王 磊

（青海省人民医院a.急诊外科；b.普外科；c.肿瘤外科；d.病理科，西宁 810000）

胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，在全球恶性肿瘤死亡率中排名第二，其恶性程度高，早期症状隐匿，大部分患者入院就诊时已为中晚期，临床预后明显不良[1]。近年随着对胃癌发病机制的深入研究，人们发现胃癌的发生发展涉及大量致癌基因和抑癌基因的改变，基于分子靶标机制的探究已成为目前癌症研究的热点[2]。因此，积极探寻更多胃癌生物分子靶标及其相关作用机制对胃癌临床诊治具有重要积极意义。微小核糖核酸（microRNA，miRNA)是近年研究发现的一种小的非编码RNA分子，其可在转录后水平调控靶基因的表达[3]。据报道，miRNAs 在人类癌症中经常处于失调状态，通过发挥致癌或抑癌基因作用参与人类多种恶性肿瘤的生物过程，例如细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡、耐药等，被证实是许多疾病和癌症的潜在分子标记物[4-5]。miR-505-3p 是近年新发现的miRNA 分子，研究证实其在肿瘤组织及细胞中异常低表达，上调miR-505-3p 可明显抑制脑胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌等的增殖及侵袭，扮演抑癌基因角色[6-8]。然其在胃癌中的作用尚不清楚，因此本研究拟探究miR-505-3p 在胃癌组织及细胞中的表达及其对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及潜在作用机制，以期为临床胃癌的研究攻克提供更多分子靶标。

1 材料与方法

1.1 研究对象 胃癌细胞系MGC803，AZ521，HGC-27 和人正常胃黏膜细胞GES1 由中国科学院提供，37℃，5ml/dl CO2条件下在含10g/dl 胎牛血清的DMEM 培养液中培养。选取2021年1月～3月青海省人民医院病理科留存的10 例胃癌患者的癌组织及对应癌旁正常组织样本进行研究，患者均在本院就诊，组织标本经病理确诊后-80℃保存于低温液氮中；患者术前未接受任何相关放化疗及新辅助治疗，未并发其他恶性肿瘤。4 周龄C57 雌性裸鼠购自上海吉辉生物科技有限公司。研究获得医院医学伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 试剂及仪器 DMEM 培养液，胎牛血清，Lip2000 转染试剂（美国Gibco 公司）；CCK-8 试剂盒(碧云天)；酶标仪（美国Bio-rad 公司）；TRIzol 试剂 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)；逆转录试剂盒(Aidlab, Beijing, China)；7500 Fast Real-Time PCR 仪(美国ABI 公司)；Transwell 小室(BD Biosciences, Bedford, MA, USA)；双荧光素酶报告检测系统(Promega, Mannheim, Germany)；光度计(Molecular Devices, U.S.A.)；miR-NC 阴性对照，miR-505-3p mimic 模拟物，pcDNA3.1 空载体，pcDNA3.1-c-MYC 过表达载体，干扰si-c-MYC 序列（上海吉玛基因生物）；c-MYC-3'UTR-wt 野生型和3'UTR-mut 突变型荧光质粒（南京科佰生物科技有限公司设计合成）。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染及分组：取待测胃癌细胞生长到85%左右时参照Lipo2000 转染说明书操作进行细胞转染，37℃，5ml/dl CO2培养48h，收集细胞进行实验。分组：NC(转染miR-NC 的miR-505-3p 阴性对照组)，miR-505-3p 过表达组(转染miR-505-3p mimic模拟物组)，Vector 组（转染pcDNA3.1-Vector 载体的c-MYC 空白对照组)，c-MYC 过表达组（转染pcDNA3.1-c-MYC过表达载体组），c-MYC敲低组（转染干扰si-c-MYC 序列组），共转染miR-505-3p 过表达+c-MYC 过表达组。

1.3.2 实时荧光定量PCR 实验（qRT-PCR）：利用TRIzol 试剂提取细胞及组织中总RNA，通过逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，并以此为模板配置PCR反应体系，利用7500 Fast Real-Time PCR 仪进行qRT-PCR；反应条件：95℃ 30s，95℃15 s，72℃10s，循环40 次。采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达。引物如下：c-MYC：正向5’-TGAGGAGA CACCGCCCAC-3’，反向5’-CAACATCGATTTCTTC CTCATCTTC-3’；miR-505-3p：正向5’-CTACGTGG GTCACCCCCTC-3’，反向5’-CCAAAGGAGACCTC GTAGT-3’；GAPDH：正向 5’-TGTTCGTCATGGGTG TGAAC-3’，反向 5’- ATGGCATGGACTGTGGTCA T-3’。

1.3.3 CCK-8 细胞增殖实验：取转染后各组细胞以1×104/孔接种到96 孔板，每孔设3 个复孔，37 ℃，5ml/dl CO2孵育48h 后每孔加入含10g/dl CCK-8 试剂的DMEM 培养液继续孵育0，24，48，72 h，酶标仪在450 nm 处测量吸光度值（A值），绘制增殖曲线，实验重复3 次取平均值。

1.3.4 克隆斑点形成实验：取对数生长期各组细胞，胰酶消化，以每孔200 个细胞铺于6 孔板，每孔设3 个复孔，37℃，5ml/dl CO2培养至出现肉眼可见的克隆时收集细胞，加入4g/dl 多聚甲醛固定20 min，0.1g/dl 结晶紫染色30 min，观察拍照分析。

1.3.5 裸鼠成瘤实验：取对数生长期细胞胰酶消化，PBS 清洗2 次，用无血清培养液吹打细胞沉淀制成细胞悬液，浓度1×107/ml，接种到裸鼠皮下，每周2 次利用游标卡尺测量肿瘤最长最短部位，第30天处死小鼠，取肿瘤组织进行称重。

1.3.6 Transwell 侵袭、迁移实验：采用Transwell 小室，根据试验说明书操作进行检测。迁移检测：用无血清DMEM 培养液重悬细胞，浓度1×106/ml，在小室上室加入细胞悬液，下室加入600 μl 含10g/dl 胎牛血清的DMEM 完全培养液，培养24 h；取出小室，吸干上室培养液，4g/dl 多聚甲醛固定30 min，0.05g/dl 结晶紫染色30 min，湿棉签擦除上室多余细胞，晾干，倒置光学显微镜下观察并计数。侵袭检测：Transwell 小室上室底部中央铺上Matrigel 基质胶，下室加入600 μl 含10g/dl 胎牛血清的DMEM 完全培养液，上室加入细胞悬液，其余操作同细胞迁移检测。

1.3.7 蛋白免疫印迹实验：取转染后各组细胞加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度；取蛋白样品，SDS-PAGE 电泳分离，待蓝色条带跑出即进行电转，100 V 电转2 h，转移到PVDF 膜，5g/dl 脱脂奶粉封闭1 h，PBST 洗膜2 次，加入一抗孵育过夜；次日PBS 清洗2 次，加入二抗室温孵育2 h，PBS 清洗3 次，化学发光法进行显色，凝胶成像仪观察拍照，Image-J 软件进行灰度分析。

1.3.8 双荧光素酶报告基因实验：取对数生长期各组细胞接种到6 孔板，将包含miR-505-3p 结合位点在内的含有海肾荧光素酶报道质粒的c-MYC 野生型和突变型荧光质粒转染至待测细胞中，使用荧光素酶测定系统测量各组细胞荧光素酶活性，实验重复3 次取平均值。

1.3.9 生物信息学分析：利用TargetScan (http://www.targetscan.org/) 网站预测miR-505-3p 可能的靶基因，并验证两者的结合关系。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0 统计软件进行统计分析, 实验数据采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验；癌组织及癌旁组织差异比较采用配对t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织及细胞中miR-505-3p 表达 qRTPCR 检测显示，相对正常癌旁组织（1.74±0.59），10 例临床胃癌组织（0.92±0.37）中miR-505-3p 表达水平显著下调，差异有统计学意义（t=3.723，P＜0.01）；同时胃癌细胞系MGC803（1.12±0.35），AZ521（2.31±0.24），HGC-27（2.28±0.43） 中miR-505-3p 相对表达均较人正常胃黏膜细胞系GES1（4.62±0.79）明显降低，差异有统计学意义（F=26.109，P＜0.001），MGC803 细胞系降低最显著，故选择该细胞用于后续实验。

2.2 miR-505-3p表达对胃癌增殖、克隆形成及迁移、侵袭的影响 见表1。qRT-PCR 检测发现， miR-505-3p 过表达组（4.91±0.68）细胞中miR-505-3p 相对表达量较NC 组（1.86±0.93）显著上调，差异有统计学意义(t=4.586，P＜0.01)，表明miR-505-3p 过表达细胞系构建成功。CCK-8 法检测显示，转染72 h 后miR-505-3p 过表达组细胞增殖能力较NC 组明显降低(P＜0.05)；克隆形成实验证实，miR-505-3p 过表达组细胞克隆形成数目较NC 组明显降低 (P＜0.05)；Transwell 实验检测显示，miR-505-3p 过表达组细胞迁移、侵袭数目均较NC 组明显降低（P＜0.01），差异有统计学意义。见图1，体内裸鼠成瘤实验证实，miR-505-3p 过表达抑制了肿瘤生长(图1A)，包括对肿瘤体积(图1B)和重量(图1C)的抑制。提示miR-505-3p 过表达能明显抑制胃癌细胞的增殖、克隆形成及迁移、侵袭，其在胃癌发生发展中扮演抑癌基因。

表1 miR-505-3p 过表达对胃癌细胞增殖、克隆形成及迁移、侵袭的影响（±s）

表1 miR-505-3p 过表达对胃癌细胞增殖、克隆形成及迁移、侵袭的影响（±s）

类 别NC 组miR-505-3p 过表达组tP增殖A 值1.85±0.340.92±0.273.710＜0.05克隆形成数目(个)128.36±36.4251.67±21.753.131＜0.05细胞迁移数目(个)100.08±2.1243.25±15.476.304＜0.01细胞侵袭数目(个)100.12±1.9438.53±14.767.166＜0.01

图1 体内裸鼠成瘤实验检测miR-505-3p 对肿瘤生长(体积和重量)的影响

2.3 miR-505-3p与c-MYC靶向关系验证 见图2。经检索生物信息学数据库发现，miR-505-3p 与c-MYC 的3’UTR 区存在特异性结合位点，推测c-MYC 可能是miR-505-3p 的下游靶点（图2A）。研究通过构建包含有miR-505-3p 结合位点的c-MYC 3’UTR-WT 野生型和3’UTR-Mut 突变型荧光素酶报告载体，并与miR-505-3p 过表达mimic 片段共转染到MGC803 细胞中，经双荧光素酶报告基因实验证实，转染miR-505-3p 过表达明显降低了c-MYC-3’UTR-WT 型荧光素酶活力（P＜0.001），而对c-MYC-3’UTR-Mut 型荧光素酶活力无明显影响（P＞0.05）（图2B），说明c-MYC 和miR-505-3p 之间存在靶向作用关系，c-MYC 是miR-505-3p的潜在靶基因。

见表2。qRT-PCR 检测发现，c-MYC 过表达对miR-505-3p 表达无明显影响(P＞0.05)；miR-505-3p 过表达明显抑制了c-MYC 表达（P＜0.01），共转染c-MYC 过表达载体后恢复并促进了c-MYC 表达(P＜0.001) 。说明miR-505-3p 靶向负调控c-MYC表达。注： ①与②比较，t=6.427，3.659，均P＜0.005。①与③比较，t=6.282，6.802，均P＜0.005。②与③比较，tc-MYC=10.461，P＜0.001。

图2 荧光素酶报告实验验证miR-505-3p 和c-MYC 的靶向关系

表2 miR-505-3p 与c-MYC 间的表达调控关系（±s）

表2 miR-505-3p 与c-MYC 间的表达调控关系（±s）

基因表达NC 组①miR-505-3p 过表达组② miR-505-3p 过表达 + c-MYC 过表达组③Fp miR-505-3p 1.02±0.034.13±0.764.06±0.6926.909＜0.001 c-MYC 1.01±0.020.23±0.042.46±0.4556.360＜0.001

2.4 miR-505-3p 调控c-MYC 对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响 见表3。qRT-PCR 检测显示，c-MYC 过表达组（2.59±0.67）细胞中c-MYC 表达较Vector 组（1.02±0.01）明显增高，差异有统计学意义（t=4.058，P＜0.05）；c-MYC 敲低表达组（0.31±0.02）细胞中c-MYC 表达较Vector组（1.02±0.01）明显降低，差异有统计学意义（t=54.996，P＜0.001），说明过表达/敲低c-MYC表达细胞系稳转成功。细胞实验检测显示，c-MYC过表达组细胞增殖、迁移及侵袭能力较NC 组明显升高（P＜0.01），共转染c-MYC 过表达逆转了miR-505-3p 对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，其水平恢复基本接近正常，表明miR-505-3p可通过靶向负调控c-MYC 表达参与胃癌细胞的生物学行为。

表3 miR-505-3p 调控c-MYC 对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响（±s）

表3 miR-505-3p 调控c-MYC 对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响（±s）

注：①与②比较，t=2.625，5.380，5.513，均P＜0.05。①与③比较，t=2.455，4.456，4.058，均P＜0.05。②与④比较，t=2.371，5.681，5.312，均P＜0.05。

类别NC 组①miR-505-3p过表达组②c-MYC 过表达组③miR-505-3p 过表达+ c-MYC 过表达组④FP细胞增殖A 值1.85±0.340.92±0.272.72±0.681.76±0.328.625＜0.05细胞迁移数目(个)100.08±2.1243.25±15.47147.15±20.36103.26±3.3532.526＜0.005细胞侵袭数目(个)100.12±1.9438.53±14.76145.46±22.7397.87±3.2530.813＜0.005

2.5 miR-505-3p 调控c-MYC 对Wnt/β-catenin 信号通路的影响 见表4。Western blot 检测显示miR-505-3p 过表达组Wnt，β-catenin 相对表达较NC组明显降低（P＜0.05）；c-MYC 过表达组Wnt，β-catenin 相对表达较NC 组明显升高（P＜0.05），差异均有统计学意义；共转染miR-505-3p 过表达组+c-MYC 过表达组Wnt 和β-catenin 相对表达被逆转，接近正常水平。提示c-MYC 可以逆转miR-505-3p 过表达对信号通路的抑制作用，miR-505-3p通过靶向调控c-MYC 参与Wnt/β-catenin 信号通路激活进而影响胃癌的发生发展。

表4 miR-505-3p 和c-MYC 相互作用 对Wnt/β-catenin 通路关键蛋白表达的影响（±s）

表4 miR-505-3p 和c-MYC 相互作用 对Wnt/β-catenin 通路关键蛋白表达的影响（±s）

注：①与②比较，t=8.139，7.342，均P＜0.001。①与③比较，t=7.399，7.342，均P＜0.001。②与④比较，t=7.695，8.048，均P＜0.001。

蛋白表达NC 组①miR-505-3p过表达组②c-MYC 过表达组③miR-505-3p 过表达+ c-MYC 过表达组④FP Wnt1.01±0.020.46±0.071.51±0.140.98±0.0580.555＜0.001 β-catenin 1.02±0.020.50±0.051.54±0.161.07±0.0472.116＜0.001

3 讨论

近年基于分子生物学的研究发现，肿瘤的发生发展是多基因、多步骤、多通路参与的复杂过程，原癌基因的激活及抑癌基因的失活导致基因异常表达，参与了肿瘤的发生发展[9]。研究发现，miRNAs 作为重要的基因调控因子，可与mRNA 的3’非翻译区互补结合使其靶向降解、阻止其翻译，通过表观遗传学水平影响基因表达，一定条件下可作用原癌或抑癌基因发挥作用[3]。证实miRNAs 表达失调可以参与维持肿瘤细胞增殖、细胞死亡抵抗、侵袭转移激活及血管生成和多药耐药，参与生物体内多种重要的生理过程[10]。越来越多研究证实，miRNAs 与包括胃癌在内的多种肿瘤的发生发展关系密切，是肿瘤预后评估的潜在标记物及治疗靶点[11]。因此，积极探究miRNAs 在胃癌发生发展中的生物学功能及作用意义显著。

研究表明，miR-505-3p 是一种肿瘤相关基因，是促进肿瘤形成发展的原癌基因，也是肿瘤抑制基因[6]。如既往研究报道，lncRNA KTN1-AS1 通过负向调控miR-505-3p促进胶质瘤细胞增殖和侵袭[12]。lncRNA ZEB1-AS1 通过调控miR-505-3p/trib2 轴促进胰腺癌进展[7]。miR-505-3p 下调预示着前列腺癌无骨转移生存期较差[8]。miR-505-3p 可抑制乳腺癌细胞增殖，促进耐药细胞凋亡；lncRNA DLX6-AS1通过调控 miR-505-3p/RUNX2 轴促进乳腺癌的发生发展，表明miR-505-3p 在肿瘤恶性进展中的致癌基因属性[13]。此外还发现，SRSF1 自结合机制抑制miR-505-3p 抑制神经肿瘤细胞系增殖。提示miR-505-3p 与癌症的发生发展关系密切，是肿瘤研究的新的分子靶标[14]。本研究经探究miR-505-3p 在胃癌中的表达作用，发现胃癌组织及细胞中miR-505-3p 表达下调，上调miR-505-3p 可显著抑制胃癌细胞增殖、克隆形成及迁移、侵袭，发挥抑癌基因作用。肿瘤中不同miRNA 通过不同靶基因发挥作用，因此研究利用生物信息学对其发挥作用的靶标基因进行分析，证实c-MYC 是miR-505-3p 的下游靶标，miR-505-3p 负向调控c-MYC 表达。研究报道，c-MYC 表达与胃癌患者预后呈正相关[15]；c-MYC促进了前列腺癌的发生发展，MYC 癌基因参与了许多人类癌症的发生[16]，最新对其表达和功能的研究为肿瘤治疗提供了可能。另发现类药物分子可以抑制溴域蛋白对MYC 的激活，从而在体内抑制肿瘤，其对肿瘤起始具有重要调控作用[17]。本研究结果表明miR-505-3 通过靶向调控c-MYC 表达来参与胃癌细胞的生物学行为。

肿瘤基因发挥作用常与相关信号通路的激活或失活关系密切。目前研究发现与胃癌恶性转化及进展相关的信号通路有NF-rB，Wnt/β-catenin 及JAK/STAT 等，其中对Wnt/β-catenin 通路的研究较为成熟。Wnt/β-catenin是调节生长发育的关键途径，其传导途径主要由膜蛋白受体和配体蛋白质Wnt 结合激活，参与细胞生长、增殖、凋亡及组织稳态的调控；β-catenin 是E-cadherin 结合蛋白，可参与细胞间的黏附调节，是Wnt 信号通路的转录调节因子，并证实Wnt 通路与EMT 诱导过程关系密切[18-19]。如据相关研究报道，膀胱癌中Wnt/β-catenin 减弱细胞间黏附诱导EMT 发生过程，在膀胱癌转移中起重要作用[20]。LI 等[21]研究报道，VGLL4 通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路抑制EMT，参与胃癌细胞的迁移及侵袭。并有研究报道，Wnt 途径失调是引起人类恶性肿瘤发生进展的启动因素，约≥40%的胃癌组织细胞中Wnt/β-catenin 信号传导异常改变[22]。猜测miR-505-3 靶向调控c-MYC 参与胃癌发生发展可能与Wnt/β-catenin信号通路激活有关。本探究进一步探究发现，miR-505-3p 过表达可抑制Wnt/β-catenin 信号通路激活，c-MYC 可逆转miR-505-3p mimic 对信号通路的抑制作用，证实miR-505-3p 通过靶向调控c-MYC 介导Wnt/β-catenin信号通路激活进而影响了胃癌的发生发展。然其更深入的作用机制还需后期进一步探究分析，对miR-505-3p/c-MYC 轴的进一步研究可为开发新的胃癌治疗策略提供基础。

综上所述，胃癌组织细胞中miR-505-3p 表达显著下调，过表达miR-505-3p 可显著抑制细胞的增殖、克隆形成及迁移、侵袭，是一个潜在的胃癌防治靶点。miR-505-3p 通过靶向调控c-MYC 表达介导Wnt/β-catenin 信号通路激活进而发挥作用参与胃癌的发生发展过程。