循环外泌体miRNA检测对肝细胞癌临床诊断效能的Meta分析

王 路,叶 莎,韩 霞,伏建峰

（1.巴音郭楞蒙古自治州人民医院医学检验科,新疆库尔勒 841000;2.新疆军区总医院临床检验中心,乌鲁木齐 830000）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病人数占癌症总病例数的9.2%，死亡人数占癌症总死亡人数的12.9%，分别居恶性肿瘤的第4 位和第2 位[1]。据报道，HCC 早期症状不明显，绝大部分确诊时已是中晚期，生存率不足10%，这凸显了早期诊断的重要性[2-3]。目前，HCC 的诊断方法有病理学诊断、影像学检查、甲胎蛋白（alpha fetoprotein, AFP）和α-L-岩藻糖苷酶（α-L-fucosidase, AFU）检测等，但这些方法在HCC 的诊断中均具有一定局限性。研究显示，外泌体可反映细胞功能。近年来，国内外研究者尝试将外泌体作为新型的疾病诊断标志物，尤其在肿瘤领域[4]。业已证实，HCC 的发生和演变与微小核糖核酸（miRNA）有关，特别是外泌体miRNA。目前已有不少文献报道miRNA 可作为HCC 早期诊断及病情监测的生物标志物[5]，但由于外泌体miRNA 的种类、检测谱、标本来源等不同，造成诊断效能有所差异。因此，有必要系统、全面地评估外泌体miRNA 用于HCC 诊断的可行性。本研究采用Meta 分析评估循环外泌体miRNA 对HCC 的整体临床诊断价值，旨在为循环外泌体miRNA 作为生物标志物应用于临床诊断HCC 提供数据支持和参考。

1 材料与方法

1.1 资料来源 收集截止2020年1月21日循环外泌体miRNA检测对HCC临床诊断效能的相关文献。纳入标准：①病例组中研究对象均为病理学检查或美国肝病研究学会（AASLD）确诊的HCC 患者；②对照组人群为无任何恶性肿瘤病史的成年人，不排除伴有肝炎、肝硬化；③在HCC 患者手术、放化疗前采集外周血标本；④诊断效能评价指标必须包括灵敏度、特异度。排除标准：①综述、系统评价、会议摘要等非实验研究型文献；②研究标本为病理组织、动物实验；③重复发表的研究。

1.2 方法

1.2.1 检索策略：检索PubMed, Embase, Cochrane Library, Web of science，中国期刊全文数据库（CNKI）、万方数据库（Wan Fang）、中国生物医学文献检索数据库（CBM）和维普咨询中文期刊服务台（VIP）,检索词包括“Liver Neoplasms”“肝肿瘤”“肝细胞癌”“MicroRNAs”“微RNAs”“miRNA”“Exosomes”“外泌体”“Diagnosis”和“诊断”等。

1.2.2 质量评价：由2 位作者通过逐一阅读文献进行独立筛选并提取资料，提取资料包括第一作者、发表年份、研究对象所在国家、对照来源、样本量、样本类型、miRNA 检测谱、真阳性(true positive, TP)、假阳性(false positive, FP)、真阴性(true negative, TN)、假阴性(false negative, FN)等。双方同时纳入文献，各自独立采用诊断准确度质量评价工具QUADAS-2 从4 个方面对文献质量进行评价，偏倚风险分为：高、不清楚、低三类，存在分歧的文献最后通过与相关专家协商讨论解决。

1.3 统计学分析 采用RevMan 5.3 统计软件中QUADAS 2(quality assessment of diagnostic accurocy studies 2)绘制文献质量评价图，应用Meta Disc1.4软件计算灵敏度对数与（1-特异度）对数之间的spearman 相关系数，以分析阈值效应，P＜0.05 提示存在阈值效应；计算诊断比值比（diagnostic odds ratio, DOR)的Cochran-Q 值、I2值，以检验非阈值效应异质性，若P＞0.05 且I2＜50%，则无非阈值效应异质性，采用固定效应模型合并效应量；若P＜0.05 且I2＞50%，则存在非阈值效应异质性，采用随机效应模型合并效应量；采用亚组分析，以查找非阈值效应异质性来源或原因；应用Stata 14.0软件绘制Deek’s 漏斗图以检验发表偏倚，P＜0.05提示比对组之间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检索结果 通过8 种数据库初步检索文献256篇，剔除重复文献47 篇，剩余209 篇，再严格按照纳入及排除标准筛选，最终纳入分析文献10 篇，共计12 项研究，包括775 例HCC 患者和957 例非HCC 对照人群。纳入文献均发表于2017 ～2020年，文献基本特征见表1。

2.2 质量评价 将纳入研究采用QUADAS-2 从风险偏倚（病例选择、待评价试验、金标准、病例流程和进展）和临床适用性（病例选择、待评价试验、金标准）7 个方面进行质量评价，12 篇文献中有11 篇5 项低风险（其中有4 篇2 项高风险，有7 篇1 项高风险，1 项不确定）；1 篇4 项低风险，3 项高风险，结果显示纳入文献质量较高，均符合QUADAS 2 中的大部分标准。

2.3 Meta 分析结果

2.3.1 阈值效应：将纳入10 篇文献中的12 项研究数据导入Meta DiSc 14.0 软件进行分析，结果显示灵敏度对数与（1 特异度）对数之间的spearman 相关系数为-0.186（P=0.563），不显著，提示本次研究不存在阈值效应；进一步，通过绘制对称SROC曲线，未见“肩臂状”出现，再次提示并映证本次研究无阈值效应。

2.3.2 异质性评价：DOR 的Cochran -Q 检验显示Cochran -Q=35.88,P＜0.001，提示本研究存在非阈值效应引起的异质性。因本次研究的灵敏度、特异度、阳/阴性似然比、DOR 的I2均大于50%，故下一步研究采用随机效应模型对以上5 个效应量进行合并。

2.3.3 效应量合并值：结果显示， 外泌体miRNA 诊断HCC 的合并灵敏度为0.892（95%CI：0.868～0.913），合并特异度为0.884（95%CI：0.862～0.904），见图1，合并阳性似然比为7.019（95%CI：4.819～10.224），合并阴性似然比为0.122（95%CI：0.074～0.200），合并DOR=63.695（95%CI：33.937 ～119.55）；AUC 为0.950 7，Q=0.891 4，提示循环外泌体miRNA 对HCC 的诊断具有较好的参考价值，见图2。

表1 纳入文献基本特征

2.3.4 亚组分析：见表2。鉴于上述方法证明纳入研究结果间存在由非阈值效应引起的异质性，故进一步按照对照组来源、外泌体miRNA 检测谱、外泌体miRNA 检测个数进行亚组分析，查找异质性来源。结果显示对照组为健康人群和混合人群、外泌体miRNA 检测谱、单个外泌体miRNA 检测研究间存在异质性，而对照组为慢性肝病、多个外泌体miRNA 联合检测无异质性。

另在亚组分析发现，含有外泌体miRNA-122 诊断HCC 的DOR, AUC 高于不含外泌体miRNA-122的DOR, AUC；多个外泌体miRNA 联合检测的DOR, AUC 高于单个外泌体miRNA 检测的DOR,AUC。提示联合检测，尤其包含外泌体miRNA-122的联合检测可提高HCC 的诊断效能。

2.3.5 Deek’s 发表偏倚检验：见图3。应用Stata 14.0 对本研究的数据进行发表偏倚检验，结果显示漏斗图对称，P=0.57，提示本次研究不存在发表偏倚。

图1 外泌体miRNA 诊断HCC 的合并灵敏度、特异度

图2 外泌体miRNA 诊断HCC 的DOR，AUC

图3 Deek’s 发表偏倚

2.3.6 临床效果评价：应用 Fagan’s 列线图进行临床效果评价。当设定验前概率为50%时，检测循环外泌体miRNA 为阳性，则被检测者患有HCC 的概率为89%；检测循环外泌体miRNA 为阴性，则被检测者患有HCC 的概率为9%。提示循环外泌体miRNA 诊断HCC 具有较好的临床价值。

3 讨论

肝细胞癌（HCC）是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其发病隐匿，早期诊断困难，且具有不良的预后和高复发的风险。因此，寻找理想的HCC 诊断和疗效监控的生物标志物，一直是临床检验诊断学关注的焦点。传统的血清学标志物，如：AFP，AFU 等，已满足不了临床需求。急需我们探索既灵敏又特异的血清标志物应用于临床。

表2 外泌体miRNA 检测对HCC 诊断价值的亚组分析结果

外泌体是一种直径为30 ～100nm 的磷脂双分子膜结构的细胞囊泡，可以携带miRNA, lncRNA,mRNA，脂质和蛋白质等，将生物信息传递给受体细胞，在正常或疾病状态下发挥其生理及生物学作用[16]。研究证实，外泌体的脂质双分子膜对miRNA 起保护作用，阻止其内容物抵抗核糖核酸酶和蛋白酶降解[17]，使其在外周血中能够长期稳定的表达并被检测出来。有研究表明，miR-122[18]，miR-125b[19]等可作为HCC 诊断的潜在生物标志物；而经深度测序筛选HCC 和肝硬化之间差异表达的血清外泌体miR-122,miR-148a 和miR-1246，通过ROC 曲线评估诊断效能，发现血清外泌体miR-122是区分HCC 和肝硬化的最佳指标[9]。因此，循环外泌体miRNA 很可能成为诊断HCC 的新的生物标志物，值得进一步研究。

本研究依托8 种文献收录数据库平台，检索并筛选循环外泌体miRNA 对HCC 诊断效能的相关文献，行Meta 分析。结果显示，循环外泌体miRNA诊断HCC 的合并灵敏度、合并特异度优于传统的血清学指标AFP 和AFU[20]。研究中发现，纳入研究结果间存在由非阈值效应引起的异质性，故进一步按照对照组来源、外泌体miRNA 检测谱、外泌体miRNA 检测个数进行亚组分析，查找异质性来源。结果显示，对照组为健康人群和混合人群、单个外泌体miRNA 检测、外泌体miRNA 检测谱存在异质性。究其原因：①慢性肝病、混合人群因疾病状态可能会引起自身外泌体miRNA 表达的改变；②不同外泌体miRNA 检测谱对HCC 诊断效能有所差异。

临床应用经验表明，联合诊断模式的效能往往优于单一指标，循环外泌体miRNA 应用于HCC 诊断亦是如此。研究中发现，含有外泌体miRNA-122的组合诊断模式，其诊断HCC 的DOR，AUC 相比不含外泌体miRNA-122 组合模式诊断效能更佳，WANG 等[9]的报道也证实了这一点。此外，多个外泌体miRNA 联合检测诊断HCC 的AUC 也较单指标大，提示循环外泌体miRNA 多指标联合检测也可提高HCC 诊断效能。

本研究系统评价了循环外泌体miRNA 在HCC中的临床诊断价值，尝试为临床亟待解决血清学标志物诊断HCC 的难题，提供一种立足于现有研究基础的分析思路。分析研究结果达到预期目的，但也存在不足和局限：①符合纳入标准的文献偏少，部分数据不全的文献，未联系到作者；②部分文献在原文中未直接提取到真阳性、假阳性、真阴性和假阴性数据，而是间接通过敏感度、特异度并结合研究人数计算所得；③纳入研究的外泌体miRNA检测谱、检测个数、对照组来源等不同，导致各研究间存在非阈值效应引起的异质性，可能在一定程度上对本研究结果造成影响。但以上不足和局限不影响循环外泌体miRNA 成为诊断HCC 的新的生物标志物，当然，如何将其应用于临床？包括基于满足临床所需诊断效能的miRNA 的遴选、miRNA 组合的优化等，尚需临床应用实践的检验。综上所述，循环外泌体miRNA 诊断HCC 的敏感度、特异度和AUC 可满足临床所需，其可作为一种潜在的新的生物标志物应用于HCC 临床诊断。