维生素D受体基因多态性与儿童难治性肾病的相关性研究

谭 璐，史瑞明，吴红艳，黄燕萍

(西安交通大学第一附属医院儿科，陕西 西安 710061)

肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)是儿童期较为常见的慢性免疫性疾病，近年来发病率逐年增加，约占同期住院泌尿系统疾病患儿的20%。糖皮质激素一直是治疗原发性肾病综合征公认的首选药物。据不完全统计，有近半数的患儿出现激素依赖或耐药，转为难治性肾病，成为临床极为棘手的问题。新型免疫制剂如麦考酚酯、他克莫司、利妥昔单抗等对难治性肾病有一定的治疗效果，但仍有部分患儿病情持续进展，最终进入终末期肾病阶段。目前已有证据表明维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)激动剂具有独立于钙磷代谢外的肾脏保护作用，可改善慢性肾脏疾病的缓解率[1]。由于VDR基因单核苷酸多态性的存在，不同位点发生基因突变，将导致VDR蛋白结构和功能发生改变，影响其生物学效应。目前针对儿童难治性肾病与VDR基因相关性研究的报道较少，本研究拟通过3个经典VDR受体基因位点Fok I(rs2228570)、Bsm I(rs1544410)及Apa I(rs7975232)，探讨VDR基因多态性与儿童难治性肾病的关系，为今后药物治疗靶点提供新思路。

1资料与方法

1.1研究对象

本研究对象分为病例组和正常对照组。病例组：选取2019年1月至2019年12月于我院儿科住院的难治性肾病患儿45例，均为汉族，男童34例，女童11例，年龄为5～13岁。纳入标准：符合《诸福堂儿科学(第八版)》肾病综合征诊断标准，且对激素依赖或耐药者。排除标准：狼疮性肾炎、紫癜性肾炎、乙型肝炎相关肾炎、链球菌感染后肾炎等具有肾病综合征表现的继发性及原发性肾炎；存在骨代谢基础疾病者；遗传代谢性疾病；合并其他自身免疫性疾病；肿瘤性疾病；长期服用其他影响骨代谢的药物(糖皮质激素除外)；依从性差，不能定期随访者。所有入组病例随访2年。正常对照组：选择我院儿保科门诊健康体检的儿童95例，既往无泌尿系统疾病及内分泌疾病史，均为汉族，男童51例，女童44例，年龄5～10岁。本研究获我院伦理委员会审批通过(XJTU1AF2018LSK-203)，所有入选者均签署知情同意书。

1.2 VDR基因多态性检测

采集所有研究对象口腔黏膜脱落上皮细胞，经过洗涤、纯化后获得基因组DNA，检索NCBI 获取维生素D 受体基因编号为Fok I(rs2228570)、Bsm I(rs1544410)及Apa I(rs7975232)位点，行DNA酶切，加入特异性引物，采用TaqMan荧光探针技术检测以上3个位点单核苷酸多态性，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)引物及探针由安徽中科生物科技有限公司设计并合成。引物序列、扩增片段长度及探针见表1。PCR 反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃ 延伸5min。PCR产物37℃酶切过夜，1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统观察扩增条带并记录基因型条带，由第三方医学检验实验室进行纯化测序验证。

表1 VDR引物名称及序列

1.3其他指标测定

所有研究对象入组后即采集空腹血，测定血肌酐、尿素、血清活性维生素D3水平；病例组定期监测尿蛋白、血肌酐、尿素值。上述指标测定由我院检验科完成。

1.4统计学方法

应用SPSS 18.0软件进行统计分析，非正态分布的计量资料采用中位数和四分位数间距[M(Q1,Q3)]描述，两组间比较采用Wilcoxon符号秩和检验；计数资料采用例数(n)和百分比(%)描述，组间比较用χ2检验。计算样本基因型频率，确认其符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用Logistic回归分析法，以患儿是否发生肾病综合征为因变量，以年龄、性别、维生素D3水平、肌酐、尿素及VDR基因各位点等位基因为自变量，分析各因素对患儿的影响。采用比值比(oddratio,OR)及其95%可信区间(confidence interval,CI)表示相对风险度。检验水准α为0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组儿童一般临床资料的比较

两组儿童在性别构成比、年龄分布、活性维生素D3水平间的差异有统计学意义(Z/χ2值分别是6.12、-2.33、-6.48，P<0.05)；而血肌酐值和血尿素水平的差异无统计学意义(Z值分别是-1.06、-0.47，P>0.05)，见表2。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验结果

对病例组和对照组的VDR 3个位点Fok I(rs2228570)、Bsm I(rs1544410)及Apa I(rs7975232)基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡检验，结果显示两组样本人群基因频率符合遗传平衡法则(病例组：χ2值分别是5.44、3.59、5.53，对照组：χ2值分别是0.54、3.96、1.03，P>0.05)。

表2 两组儿童一般临床资料的比较[M(Q1,Q3),n(%)]

2.3两组儿童各位点基因多态性的比较

病例组和对照组儿童在rs2228570位点的基因型及等位基因频率、rs7975232位点的基因型及等位基因频率间的差异有统计学意义(χ2值分别为26.36、26.17、22.17、18.45，P<0.05)；而rs1544410位点基因型及等位基因频率的差异无统计学意义(χ2值分别为2.76、3.03，P>0.05)，该位点与难治性肾病发病无相关性，见表3。

表3 两组儿童各位点基因多态性的比较[n(%)]

2.4 VDR基因多态性与难治性肾病的相关性

以难治性肾病为因变量，rs2228570 位点或rs7975232位点分别与年龄、性别、血活性维生素D3水平、血肌酐及血尿素组合作为自变量，其中年龄及性别设为分类变量，进行多因素Logistic回归分析。结果显示rs2228570位点、rs7975232位点、活性维生素D3水平、性别及年龄段与难治性肾病具有相关性(P<0.05)。活性维生素D3(OR=0.79，95%CI：0.71～0.86)、rs2228570位点(OR=0.23，95%CI：0.11～0.50)是难治性肾病的保护性因素;rs7975232位点为难治性肾病发生的危险因素(OR=6.30，95%CI：2.53～15.68)。在rs2228570位点作用下，学龄儿较少发生难治性肾病(OR=0.21，95%CI：0.06～0.78)。在rs7975232位点作用下，男童较易发生难治性肾病(OR=7.09，95%CI：2.17～23.21)，见表4和表5。

表4 rs2228570位点与难治性肾病相关危险因素的Logistic回归分析结果

表5 rs7975232位点与难治性肾病相关危险因素的Logistic回归分析结果

2.5 VDR基因多态性与难治性肾病预后的关系

将rs2228570位点进一步分为野生型基因(CC)和突变型基因(CT+TT)，rs7975232位点分为野生型基因(CC)和突变型基因(CA+AA)。经糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗，难治性肾病预后依随访情况分为尿蛋白持续转阴组和尿蛋白阳性组。经χ2检验，rs2228570位点野生型和突变型基因对尿蛋白转阴的影响有统计学差异(χ2=8.14，P<0.05)，当该位点为野生型基因时患儿尿蛋白更易转阴；而rs7975232位点不论是野生型还是突变型基因对尿蛋白影响作用相当(χ2=1.23，P>0.05)，见表6。因此，rs2228570位点CC基因型与难治性肾病预后关系密切。

表6 VDR基因多态性与难治性肾病预后的关系

3讨论

近年研究发现，某些信号途径在难治性肾病发生中起着非常重要的作用。除传统的糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗外，研究者多年来试图通过阻断或激活某种信号转导通路，对难治性肾病进行“靶向治疗”。目前研究证实活性维生素D可通过与VDR结合，激活下游通路，从而发挥保护肾小球滤过膜、抑制免疫与炎症反应等作用，但VDR基因单核苷酸多态性决定了个体的预后[2-3]。国内外对于儿童难治性肾病与VDR基因多态性相关性的研究报道较少，本文通过对3个经典VDR位点进行深入研究，以期为难治性肾病的“靶向治疗”提供依据。

3.1维生素D受体各基因位点与难治性肾病的相关性分析

本研究结果显示，儿童难治性肾病男童较女童发病率更高(34例vs 11例)，这与文献报道的男女童发病比例为3.7:1较相符[2]。维生素D受体rs2228570位点存在2个等位基因C和T，3种基因型CC(野生型)，CT(杂合型)及TT(突变型)；rs7975232位点存在2个等位基因C和A，3种基因型CC(野生型)，CA(杂合型)及AA(突变型)。难治性肾病组rs2228570位点CC基因型及C等位基因频率、rs7975232位点AA基因型及A等位基因频率均显著高于健康对照组；rs1544410位点各基因型在病例组与对照组间的差异无统计学意义。这提示我们rs2228570位点、rs7975232位点与难治性肾病的发生密切相关，而rs1544410位点与难治性肾病发生可能无关。多因素Logistic回归分析提示rs2228570位点对学龄期儿童难治性肾病具有保护效应，在进一步的长期随访中发现该位点为野生型基因CC的预后更好，经联合免疫抑制剂治疗，患儿尿蛋白更易转阴。rs7975232位点成为男性患儿进展为难治性肾病的高危因素。

3.2 VitD-VDR通路在难治性肾病中的作用机制

本研究显示儿童难治性肾病的发生与VDR基因核苷酸多态性有密切关系，但并非所有位点都具有积极的正向作用，rs2228570位点具有保护效应，而 rs7975232位点则具有负性效应。我们推测这种保护效应可能的机制为VitD与VDR结合后可阻断足细胞内Wnt/β-catenin通路激活，从而保护足细胞，减轻尿蛋白，延缓慢性肾脏病的病程进展[3-6]。外源性活性维生素D的干预可上调足细胞VDR表达水平，将这种保护效应放大。而 rs7975232位点的突变可能通过影响VDR mRNA的稳定性，进而影响肾素血管紧张素系统的活性，但具体发生机制仍需进一步研究证实[7-8]。有研究者给予肾脏次全切除的雄性大鼠每天口服活性维生素D，16周后发现大鼠肾小球中结蛋白、增殖细胞核抗原表达减少，增大的肾小球体积较前恢复，蛋白尿减轻，证明活性维生素D可减轻炎性和非炎性慢性肾脏病模型的进展，有抗增殖和抑制肾脏生长的作用，其作用的主要靶细胞是足细胞和系膜细胞[9-11]。本研究也发现难治性肾病患儿活性维生素D3水平远低于正常健康儿童，且Logistic回归分析提示活性维生素D3是儿童难治性肾病的保护因素。这给予我们新的治疗思路，是否可通过增加外源性活性维生素D3的摄入量而改善难治性肾病的预后[12-13]。

本研究仅针对关中地域的汉族儿童开展，样本量有限，且VDR基因存在多个单核苷酸多态性位点，不同位点可能出现交互作用而影响实验结果，故存在一定的局限性，还有待今后进一步研究，以期为儿童难治性肾病的精准治疗提供理论依据。