lncRNA NEAT1调控miR-22-3p促进NHE5的表达对神经胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响*

曹晶晶， 李居怡， 曾 娟， 李 军， 王 奕， 唐 求△

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院 1肿瘤科 2药学部，武汉 430024

胶质瘤是颅内最常见、具高度侵袭性及较高死亡率恶性肿瘤[1]。胶质瘤具有易迁移和侵袭、凋亡抵抗和基因组不稳定等特点，虽然目前在治疗策略上取得了一定进展，如免疫治疗、立体定向放疗、新型化疗药物等已应用于临床，但由于胶质瘤易转移、易复发导致其死亡率仍较高[2-3]。因发病机制尚未明确，胶质瘤的治疗效果仍不理想[4]。此外，胶质瘤干细胞(glioma stem cells，GSCs)是具有自我更新能力的胶质瘤细胞亚群[5-6]，因其对化疗和放疗的强抗性而增加了胶质瘤的治疗难度[7]。因此，在细胞水平上探索胶质瘤的发生过程及复发、转移机制是非常有必要的。

NHE5是一种钠-氢交换蛋白，其mRNA和蛋白表达最早在脑组织中被发现，是调节细胞内pH和细胞体积的重要膜转运蛋白，主要在胶质瘤细胞系C6中表达，在正常的星形胶质细胞中没有被检测到，在C6细胞的上皮间质转化(EMT)过程中起关键作用[8-9]。NHE5通过在再循环内体和细胞质膜之间循环并酸化再循环内体囊泡而发挥作用[10]。已有研究表明，在胶质瘤细胞系C6中NHE5的表达水平明显升高，在胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用[11]。关于NHE5与不同分子信号通路之间的关系已受到广泛关注[12]，但是其在胶质瘤转移中的作用机制仍然有待深入研究。

微小RNA(microRNAs，miRNA)是一种小的非编码RNA，在转录后水平上调节基因表达，参与肿瘤的发生、进展和转移[13-14]。miR-22-3p是位于17号染色体上的含有22个核苷酸的非编码RNA，在不同的癌症中调控多种肿瘤相关基因的表达[15]。但是miR-22-3p与神经胶质瘤细胞迁移和侵袭的关系仍然不清楚。

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一组含有200个核苷酸以上的RNA序列，在细胞的增殖、转移、侵袭、凋亡和其他生物学过程中扮演重要角色[16]。lncRNA NEAT1(lncRNA nuclear enriched abundant transcript 1)在不同种类的肿瘤中作为癌基因发挥着重要作用，可以调控多种miRNAs的表达[17-18]。经过生物信息学软件DIANA的预测，lncRNA NEAT1与miR-22-3p存在潜在的结合位点。因此，本研究旨在探讨lncRNA NEAT1影响胶质瘤侵袭和迁移等过程的相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

胶质瘤细胞系C6，正常星形胶质细胞(ATCC，美国)，PCR引物和试剂盒(TaKaRa，日本)，si-NHE5、si-NEAT1、miR-22-3p模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)及相关引物(Invitrogen，美国)，lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)，DMEM、胎牛血清(Gibco，美国)，Trizol(Invitrogen，美国)，结晶紫染色液(Sinopharm Chemical Reagent，中国)，Matrigel(BD，美国)，RIPA、BCA蛋白检测试剂盒、PVDF膜(Invitrogen，美国)，NHE5抗体(Abcam，美国)，β-actin抗体(Sigma，美国)，辣根过氧化物酶二抗(Abcam，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与转染 细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。转染依据lipofectamine使用说明进行操作。

1.2.2 实时荧光定量PCR 运用Trizol法提取细胞的总RNA，反转录合成cDNA。采用一步法试剂盒进行实时荧光定量PCR，检测miR-22-3p、NHE5和NEAT1的相对表达量。相对表达量运用2-ΔΔCt法计算，引物序列分别为：miR-22-3p，5′-AA-GCTGCCAGTTGAAGAACTGT-3′；NHE5，5′-AAC-ATCTCTGGTCCCTGA-3′，5′-CACGGTGACAG-CATCGTTGAGC-3′；NEAT1，5′-GAGTTAAGGCGCCATCCTCA-3′，5′-AGCACTGCCACCTGGAAAAT-3′。

1.2.3 细胞集落形成实验 将C6细胞按照每孔1×103的密度接种于6孔板并在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，每4天换液1次。2周后，将细胞用PBS冲洗并用甲醇固定和结晶紫溶液染色，在显微镜下计数克隆数。

1.2.4 划痕实验 在6孔板中按照每孔1×104的密度接种C6细胞，然后转染miR-22-3p mimic，si-NHE5及相应的对照核酸序列。用吸头划出痕迹后开始观察0到48 h细胞的生长情况。

1.2.5 Transwell实验 在C6细胞系中转染miR-22-3p mimic，miR-22-3p inhibitor及对照核酸序列。72 h后收集细胞，将3×104个细胞接种于覆盖了Matrigel的上层小室中，加入100 μL无血清的DMEM培养液。在下层小室中加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液。24 h后细胞通过Matrigel迁移到下层后用甲醇固定并用结晶紫溶液染色15 min。对细胞迁移能力的检测除未在上层覆盖Matrigel外，其它步骤同上。最后用Image J软件计数迁移和侵袭的细胞数。

1.2.6 蛋白质免疫印迹 转染结束后，收集细胞用RIPA裂解缓冲液裂解，BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。定量蛋白用12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将电泳条带转到PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉封闭2 h。按照1∶1000的比例配制一抗并将膜密封于4℃振荡过夜，第2天经3次洗膜后孵育二抗2 h。最后在ChemiDoc MP图像系统上进行显影。以β-actin为内参。

2 结果

2.1 lncRNA NEAT1、miR-22-3p在C6细胞系中的表达

既往研究表明，lncRNA NEAT1在肿瘤细胞中表达上调，为了进一步确认lncRNA NEAT1和miR-22-3p在神经胶质瘤细胞系中的表达情况，运用qRT-PCR检测了lncRNA NEAT1和miR-22-3p在正常星形胶质细胞和C6细胞系中的表达。与正常星形胶质细胞相比，C6细胞系中的lncRNA NEAT1表达明显升高(图1A)，而miR-22-3p的表达明显降低(图1B)。lncRNA NEAT1和miR-22-3p在神经胶质瘤细胞中差异化表达。

NC:正常星形胶质细胞;A：lncRNA NEAT1的表达；B：miR-22-3p的表达；与NC组比较，**P< 0.01图1 lncRNA NEAT1和miR-22-3p在神经胶质瘤细胞系中的表达Fig.1 Expression of lncRNA NEAT1 and miR-22-3p in glioma cell lines

2.2 过表达miR-22-3p抑制神经胶质瘤细胞系迁移和侵袭

为了进一步确认miR-22-3p对C6细胞系的作用，通过直接转染miR-22-3p mimic到C6细胞系中，检测其对细胞迁移和侵袭的影响。首先在C6细胞系中转染miR-22-3p mimic，结果提示转染后细胞系中miR-22-3p的相对表达量明显增加(图2A)；细胞集落形成实验证明，转染miR-22-3p mimic后细胞克隆数明显减少(图2B)；细胞划痕实验结果提示转染miR-22-3p mimic后细胞的迁移能力明显降低(图2C)；进一步通过Transwell实验验证转染miR-22-3p mimic后对细胞迁移和侵袭的影响，结果表明C6细胞的迁移和侵袭能力均受到抑制(图2D)。综上，miR-22-3p对神经胶质瘤的增殖、侵袭和迁移能力具有抑制作用。

NC:对照C6细胞;A：C6细胞系转染miR-22-3p mimic后miR-22-3p的表达量；B：细胞集落形成实验检测转染miR-22-3p mimic对C6细胞系增殖的影响；C：细胞划痕实验检测转染miR-22-3p mimic对C6细胞系迁移的影响；D：Transwell法检测转染miR-22-3p mimic对C6细胞系迁移及侵袭的影响；与NC组比较，**P< 0.01图2 miR-22-3p抑制神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭Fig.2 miR-22-3p inhibits proliferootion，migration and invasion of glioma cells

2.3 过表达NHE5降低miR-22-3p对神经胶质瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用

运用生物信息学软件(Targetscan和DIANA)预测发现与神经胶质瘤细胞迁移和侵袭相关的基因包括FOXG1、NHE5、IGF1R、RAB1A、ATF3、HMGB1等，进一步通过GEO查询发现在C6细胞中NHE5起主要作用。在C6细胞系中转染miR-22-3p mimic可以明显降低NHE5的mRNA和蛋白表达水平(图3A、3B)；而过表达NHE5则可促进C6细胞转移和侵袭的作用(图3C、3D)。因此，NHE5在促进胶质瘤细胞系的迁移和侵袭过程中起到重要作用。

NC:对照C6细胞;A：转染miR-22-3p mimic对C6细胞NHE5 mRNA表达的影响；B：转染miR-22-3p mimic对C6细胞NHE5蛋白表达的影响；C：过表达NHE5对C6细胞迁移的影响；D：过表达NHE5对C6细胞侵袭的影响；与NC组比较，**P<0.01；与mimic+NHE5-NC组比较，##P<0.01图3 过表达NHE5对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响Fig.3 The effect of overexpression of NHE5 on migration and invasion of glioma cell lines

2.4 lncRNA NEAT1负向调控miR-22-3p的表达而促进神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭

根据生物信息学软件DIANA预测，lncRNA NEAT1与miR-22-3p存在结合位点，因此本研究设计并合成了lncRNA NEAT1的沉默序列和miR-22-3p的抑制物，检测转染到细胞系后对lncRNA NEAT1、miR-22-3p表达量的影响及对C6细胞系迁移和侵袭的影响。

如图4所示，转染沉默序列后lncRNA NEAT1表达降低，而miR-22-3p表达升高(图4A)，共转染si-NEAT1和miR-22-3p抑制物后，C6细胞系的迁移和侵袭能力增强(图4B、4C)。总之，lncRNA NEAT1可以负向调控miR-22-3p，从而促进神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。

A：转染si-NEAT1对NEAT1和miR-22-3p表达的影响；B：si-NEAT1和miR-22-3p抑制物对C6细胞迁移能力的影响；C：si-NEAT1和miR-22-3p抑制物对C6细胞侵袭能力的影响;与si-NC组比较，**P<0.01；与si-NEAT1+NC组比较，##P<0.01图4 lncRNA NEAT1调控miR-22-3p的表达影响神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭Fig.4 lncRNA NEAT1 affects the migration and invasion of glioma by regulating the expression of miR-22-3p

3 讨论

大量研究表明，lncRNA在调控肿瘤发生发展过程中起到了至关重要的作用，如肿瘤的增殖和转移[19-20]。尽管已有报道NEAT1在神经胶质瘤中的表达明显升高，但是其对胶质瘤的生物学行为的影响仍然不清楚。因此，本研究将进一步探索lncRNA NEAT1在神经胶质瘤转移中可能的作用机制。本研究首先运用生物信息学软件DIANA预测了NEAT1可能结合的miRNA，发现miR-22-3p存在与之结合的位点。我们的研究结果表明，在神经胶质瘤细胞系C6中，沉默lncRNA NEAT1可以增加miR-22-3p的表达。同时，沉默lncRNA NEAT1也抑制了神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭，而miR-22-3p inhibitor可以逆转这种抑制效应。这些结果表明，lncRNA NEAT1可能负向调控miR-22-3p的表达从而促进神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。

由于大多数恶性肿瘤主要通过糖酵解而不是线粒体氧化磷酸化产生大量的乳酸和次级代谢产物。因此，为了克服代谢的酸性物质导致的细胞毒性，肿瘤细胞有着非常精细的调控机制，可以将胞内的H+通过钠-氢交换泵将其排到胞外，C6神经胶质瘤细胞含有大量的离子转运体，包括NHE5，因而被作为一种细胞模型广泛用于对肿瘤细胞迁移与侵袭的研究，但是NHE5与肿瘤的迁移和侵袭的关系仍然不清楚[9]。最新研究表明，在C6神经胶质瘤细胞系中稳定表达NHE5干扰质粒可以有效抑制其生长[11]。有研究结果表明NHE5的消耗可以下调由EMT、EGFR和整合素介导的信号通路，并影响NHE1在这些通路中的作用[11]。因而通过有效手段调控NHE5或许可以作为治疗神经胶质瘤的潜在策略。

lncRNA NEAT基因可编码2种亚型lncRNAs，3.7 kb的lncRNA NEAT1和23 kb的lncRNA NEAT2，它们均作为调控子在RNA的剪切和转录过程中起到关键作用。而最新的研究提示lncRNA NEAT1在多种肿瘤中扮演着肿瘤基因的角色[21]。lncRNA NEAT1在喉癌及其细胞系中表达上调，被敲减时则可抑制细胞增殖和侵袭，但是过表达时则促进癌细胞的增殖和侵袭[22]。在乳腺癌和前列腺癌等的相关研究中，lncRNA NEAT1可沉默miR-133b和miR-98-5p的表达而促进肿瘤细胞迁移和侵袭[17，23]。此外，lncRNA NEAT1与癌症治疗过程中的耐药密切相关，如在甲状腺癌和肝癌对顺铂和索拉非尼的耐药性中起到重要作用[24-25]。在本实验中，在神经胶质瘤细胞系C6中同样发现lncRNA NEAT1与肿瘤细胞的迁移和侵袭密切相关。

在结直肠癌中，LNC00858作为内源性竞争RNA抑制miR-22-3p的表达而促进癌细胞增殖、迁移和侵袭[26]。在肝癌中，miR-22-3p被lncRNA MIAT吸附而降低其表达，最终导致肝癌细胞的增殖。梓醇抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭则是通过miR-22-3p/MTA3信号通路实现[27-28]。在本实验中，lncRNA NEAT1负向调控miR-22-3p的表达而促进神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。

本研究阐明了lncRNA NEAT1、miR-22-3p及NHE5在调控神经胶质瘤细胞迁移和侵袭的联系，表明lncRNA NEAT1与miR-22-3p表达呈负相关，而miR-22-3p过表达可降低NHE5的表达，在胶质瘤细胞中lncRNA NEAT1高表达负向调控miR-22-3p提高NHE5的表达，从而促进神经胶质瘤的转移和侵袭。本研究也为胶质瘤的靶向治疗提供了新的策略。