基于网络药理学及分子对接方法探索广枣五味散治疗冠心病的活性成分*

郭 凯，赖 俊，冷梅芳，叶泽兵

广东省第二人民医院 心血管内二科(广州 510317)

目前心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是人类死亡的主要原因之一，通过生活方式干预及药物治疗，CVD患者的残留风险仍较高[1]，因此寻找能够防治冠心病(coronary artery disease,CAD)的药物对于进一步降低CAD患者主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events,MACE)的发生率具有重要意义。中国传统医学为CAD的治疗开辟了新途径，其中蒙医作为蒙古族优秀文化遗产之一，是通过吸收中医药和藏医的经验逐步形成的；且疗效明显，越来越被人们接受[2-4]。广枣五味散(guangzao wuwei san,GWS)是临床常用的蒙药之一，临床疗效确切，可改善CAD患者的症状[5-6]。GWS由5种草药组成，包含成分多，其药理机制探索困难，因此找寻GWS的活性成分并确定其靶基因，对开发新药具有重要的临床意义。本研究应用网络药理学、分子对接方法分析GWS治疗CAD的关键靶点和信号通路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 GWS活性成分的收集与筛选

GWS包含广枣、丹参、红花、肉豆蔻、檀香5种药材。GWS中的有效成分通过中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)进行分析，关键词分别为Guangzao、Danshen、Honghua、Roudoukou和Tanxiang。TCMSP包含449种草药，可获取疾病、靶点和药物之间的关系。口服生物利用度(oral bioavailability,OB)是药代动力学中的一个重要参数，与生物利用度直接相关。类药性(drug-likeness,DL)表示活性成分与现有药物的相似性。在TCMSP中，选择OB>30%和DL>0.18的活性成分用于网络构建、分子对接等后续研究(图1)。

图1 GWS对CAD作用的网络药理学分析流程图

1.2 获取GWS中活性成分与CAD相关的潜在靶点

从TCMSP数据库中获取GWS中活性成分的潜在靶点。从Genecards(https://www.genecards.org)、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM，https://www.omim.org)、PharmGKB(http://www.pharmgkb.org)、Therapeutic Target Database(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)和 DrugBank(https://go.drugbank.com/)数据库中获取与CAD治疗相关的基因靶点,并从Genecards数据库中筛选相关性得分≥30分的基因靶点。使用UniProt(https://www.uniprot.org)获取靶基因的全名、ID和简称。

1.3 成分-靶点-疾病网络的构建

为进一步探索潜在靶点和活性成分之间的关系，使用Cytoscape 3.8.0软件构建成分-靶点-疾病网络。

1.4 蛋白质之间相互作用的网络构建

STRING(http://string-db.org)为在线数据库，可用于构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protwin interaction network,PPI)的网络。目标蛋白之间的每一次相互作用都会被评分,然后将执行以下步骤：选择“multiple proteins”，输入GWS与CAD同时相关的靶基因，在“Homo sapiens”中搜索，将所需的最低相互作用分数设置为高置信度(0.9)和隐藏网络中断开连接的节点,最后将目标蛋白导入Cytoscape软件中构建PPI网络。

1.5 GO分析和KEGG分析

将GWS与CAD同时相关的靶基因放入R语言程序进行GO和KEGG分析，以探索所选靶基因在信号通路中的作用。

1.6 分子对接

1.6.1 受体结构的构建 PPI 网络核心靶蛋白的ID来自Uniprot。根据ID，受体结构以pdb格式文件从RCSB PDB(http://www1.rcsb.org/)下载,将受体结构文件导入pyMOL软件，去除分子和小分子配体后，以pdb格式保存。

1.6.2 配体结构的构建 配体的二维结构以sdf格式从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载并导入Chem3D软件中，利用MM2位置优化所有小分子的能量后，将其转换成3D结构保存为mol2格式文件。

1.6.3 分子对接 使用ADT 1.5.6软件转换受体和配体结构文件格式：将受体结构pdb格式文件导入ADT 1.5.6软件，添加氢后保存为pdbqt格式;将配体结构pdb格式文件转为pdbqt格式。受体结构通过ADT 1.5.6软件转换为2D结构。X、Y、Z维度的点数均设置为40，间距设置为 1。活动口袋参数导出为gpf格式文件，根据活动口袋参数修改输入文件，最大能量差为5，模型数为20，输出的pdbqt文件与受体文件一起导入pyMOL软件，保存最优模型。

1.7 统计学方法

在GO分析和KEGG分析进行数据筛选时，设置P<0.05。

2 结果

2.1 GWS中的活性成分

从TCMSP数据库中筛选出GWS有568种生物活性成分(其中广枣43种，丹参202种，红花189种，肉豆蔻64种，檀香70种),根据OB和DL标准选取108种有效成分(其中广枣9种，丹参65种，红花22种，肉豆蔻9种，檀香3种)进行进一步研究。

2.2 GWS中活性成分的潜在靶基因

去除重复的基因后，从TCMSP数据库中获取GWS中的活性成分有246个潜在靶基因。

2.3 GWS中活性成分与CAD相关的基因

从Genecard、OMIM、PharmGKB、TTD和DrugBank数据库中获得618个CAD相关靶基因,GWS与CAD相关的靶基因共有77个(图2～3)。

图2 5个数据库中与CAD相关基因

图3 GWS与CAD的“药物-疾病”交集靶基因图

2.4 成分-靶点-疾病交互网络的构建结果

应用网络药理分析对每个靶点的相关参数进行可视化分析，结果显示162个节点和438个边，包含85个成分和77个靶点。使用Cytoscape软件中的Network Analyzer插件进行分析显示，GWS治疗CAD有7种必需的活性成分(表1)。

表1 GWS治疗CAD的活性成分

2.5 GWS治疗CAD靶基因的PPI网络

使用STRING在线数据库构建PPI网络,该网络中有201条边和54个节点(图4)，并使用Cytoscape软件获取核心靶蛋白。如果该蛋白质的介数(betweenness centrality,BC)、接近度(closeness centrality,CC)、度数(degree centrality,DC)、特征向量(eigenvector centrality,EC)、LAC和网络中心度(network centrality,NC)>中位数，则保留该蛋白。3次过滤后(过滤条件1：BC=21.19，CC=0.15，DC=4.00，EC=0.06，LAC=1.60，NC=2.25;过滤条件2：BC=7.26，CC=0.37，DC=0.37，LAC=3.34,NC=4.39;过滤条件3:BC=1.40,CC=0.80,DC=6.00,EC=0.33,LAC=4.00,NC=4.95)，共保留基因信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、细胞肿瘤抗原p53(tumor protein P53,TP53)2个核心目标蛋白。

图4 GWS治疗CAD靶基因的PPI网络

2.6 GO和KEGG富集分析结果

使用R语言程序对GWS与CAD同时相关的靶基因进行GO分析。根据P<0.05获得2 220个GO条目，包括69个细胞成分、128个分子功能和2 023个生物过程；在细胞成分方面，潜在靶点主要涉及膜筏、膜微区、膜区等；在分子功能方面，潜在靶点主要涉及磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合和细胞因子受体结合等；在生物过程中，潜在靶点主要涉及对营养水平、氧化应激及药物的反应等(图5)。

图5 GO分析结果(前10)

使用R语言程序对GWS与CAD同时相关的靶基因进行KEGG富集分析,根据P<0.05获得137条信号通路,选择前20条信号通路(图6),其中具有代表性的为：AGE-RAGE糖尿病并发症信号通路和流体剪切力与动脉粥样硬化信号通路。

图6 靶基因的KEGG富集分析(前20)

2.7 活性成分与核心靶蛋白的分子对接

将2个核心靶蛋白(STAT3、TP53)进行分子对接，结果显示，所有活性成分均可进入并结合蛋白质的活性口袋(图 7、表2)。

图7 关键基因的分子对接

表2 分子对接得分(kcal/mol)

3 讨论

CAD在蒙医中称为“心刺痛”，是由于“三根”“七素”功能失调，阻碍赫依和气血运行。蒙药主要通过辨证浊化、活血化瘀来治疗CAD[7]。GWS是结合蒙医理论和临床实践经验，经著名蒙医专家反复确认的方剂，通过调整人体“三根”“七素”的功能来治疗CAD[7]。本研究运用网络药理学、分子对接方法分析了GWS治疗CAD的药理机制。在GWS中共筛选出108种活性成分，在GWS活性成分的靶基因中，筛选出与CAD相关的基因共77个；PPI核心蛋白分析显示，STAT3和TP53可能是GWS治疗CAD的关键靶点;GO分析和KEGG通路富集分析显示，GWS治疗CAD的信号通路有137条；分子对接分析显示，代表性活性成分与目标蛋白结合位点的结合力较高。

本研究结果显示，GWS治疗CAD必需的活性成分包括槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、β-胡萝卜素、丹参酮ⅡA、异鼠李素7种。槲皮素是一种天然生物类黄酮，可改善内皮细胞功能[8]，抑制树突细胞活化[9]，通过影响胆固醇代谢相关基因表达来调节胆固醇代谢[10-11]。山奈酚是一种常见的低分子量天然黄酮，具有多种药理作用，如抗炎、抗氧化、抗癌等。研究[12]表明，山奈酚通过调节炎症分子中基因和蛋白的表达来发挥抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)作用。木犀草素是一种天然黄酮，可抑制巨噬细胞炎症，从而抑制AS的发生[13]。柚皮素是一种柚子中的苦味成分，能改善血脂水平、抑制炎症反应[14]和AS的发生[15]。流行病学证据[16]表明，β-胡萝卜素可使低密度脂蛋白抗氧化能力增强，有助于改善AS。丹参酮ⅡA是从中草药丹参根中分离出的一种生物活性成分，可调节巨噬细胞的自噬及与AS相关的非编码RNA的表达[17-18]，改善内皮细胞功能，调节胆固醇代谢[19]。异鼠李素是一种生物活性化合物，具有抑制巨噬细胞凋亡、抗AS的作用。

PPI核心网络和分子对接分析显示，GWS的主要成分可通过影响CAD相关的基因stat3、tp53来防治CAD。CAD是冠状AS，是一种慢性、进行性、炎症性动脉壁疾病，因此stat3、tp53作为经典细胞通路的转录因子可能在AS的病理机制中发挥关键作用，尤其是炎症和免疫反应[20]。STAT3是STAT家族的一员，可能是治疗CAD的有效靶点。研究[21]表明，白细胞介素6细胞因子家族/Janus激活激酶2/STAT3信号通路在AS的内皮细胞功能障碍和免疫细胞分化中起着重要作用。此外，还有一些刺激因子可通过激活STAT3来影响AS，包括蛋白酪氨酸磷酸酶、激活STAT蛋白抑制剂和细胞因子信号3抑制因子[22]。研究[23]表明，tp53是一种转录因子，可调控细胞凋亡、细胞周期、代谢和自噬等与AS病理过程有关的生物学功能。

综上所述，本研究基于网络药理学及分子对接方法系统研究了GWS治疗CAD的活性成分、核心靶点和关键信号通路。本研究不足之处为，网络药理学是基于现有文献中的数据，预测局限，在未来研究中需深入探索活性成分的详细机制，以期为开发治疗CAD的新型药物提供指导。