分化型甲状腺癌超声造影参数与SRPX2、HSP70和MFAP2的相关性研究

石光煜，张雪松，赵丽娜，赵芳园，张磊

甲状腺癌是常见的内分泌肿瘤，发病率在我国恶性肿瘤中位居前十，并呈逐年递增趋势[1]。分化型甲状腺癌(differentiated thyroid cancer，DTC)包括乳头状和滤泡状甲状腺癌，在所有类型的甲状腺癌中约占90%[2]。尽管与其它类型相比，DTC的恶性程度较低，预后较好，但仍有部分患者预后不良，容易复发，从而影响远期生存率[3]。目前已证实多种分子标志物与DTC的预后相关，包括Sushi重复蛋白X连锁2(Sushi repeat-containing protein X-linked 2,SRPX2)、热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)和微纤维相关蛋白2(microfibril-associated protein 2，MFAP2)等。在DTC患者的病灶组织中这些蛋白的表达水平显著增加，并且与患者的疾病进展和不良预后相关[4-6]。因此，SRPX2、HSP70和MFAP2等分子标志物对DTC的预后评价和治疗方案的选择具有一定的指导意义。迄今为止，病理组织活检仍然是诊断甲状腺结节良、恶性的“金标准”，但这种诊断方式的可重复性较差，在动态监测病情进展方面具有局限性[7]。而SRPX2、HSP70和MFAP2这些分子标志物的检测也需获得活体组织标本，结合病理诊断才能完成，均为有创性方法。超声造影(contrast-enhanced ultrasonography，CEUS)是近年来兴起的甲状腺超声检查手段，能够实时反映甲状腺癌病灶内的血流情况，对甲状腺结节良、恶性的诊断具有重要价值[8]。但目前还未有文献报道CEUS参数与DTC预后相关分子标志物之间的相关性。因此，本研究旨在通过分析CEUS参数值与SRPX2、HSP70和MFAP2表达水平的相关性，为早期评估DTC患者预后提供影像学参考依据。

材料与方法

1.病例资料

选取2018年1月-2021年1月在本院就诊并行手术治疗的148例DTC患者作为研究对象，并选取同期就诊的120例良性甲状腺结节患者作为对照组。病例纳入标准：①术前行CEUS检查；②手术切除病灶，术后经组织病理学确诊，符合分化型甲状腺癌或良性甲状腺结节的诊断标准；③检查前及术前未进行抗肿瘤治疗。病例排除标准：①伴其它部位原发性肿瘤；②合并心、脑、肝和肾等功能障碍者；③合并其它内分泌疾病，合并感染性或自身免疫性疾病。

本研究的所有程序符合赫尔辛基宣言，所有患者自愿参与研究并签署了知情同意书。

2.CEUS检查方法

使用迈瑞RE7彩色多普勒超声诊断仪，探头频率为8～12 MHz。使用注射用六氟化硫微泡造影剂前向冻干粉剂内加入5.0 mL生理盐水，振荡摇匀。患者取仰卧位，充分暴露颈前区。首先行甲状腺常规超声检查，确定目标病灶后，观察并记录病灶的异常声像图特征。选择病灶最大径切面，切换为造影模式，经外周静脉团注造影剂2.5 mL，随后迅速推注生理盐水5.0 mL冲管，同时按下计时键，连续观察病灶灌注60 s，对结节内增强程度及增强是否均匀等情况进行观察。将造影动态图像导入TomTec软件进行定量分析。选择病灶内强化最明显的区域进行测量，并与其邻近同样深度的正常甲状腺组织进行比较，设定正常甲状腺腺体组织的造影强度为100，获得病灶的时间-强度曲线，并计算造影剂达峰时间(time to peak，TTP)、平均通过时间(mean transit time，MTT)和峰值强度(peak intensity，PI)。

3.分子标志物的检测及判定标准

采用免疫组织化学SP法检测DTC患者和良性甲状腺结节患者病灶组织中的SRPX2、HSP70和MFAP2表达水平，试剂盒均购自福建迈新生物技术开发有限公司。检测结果采用双盲法评估，诊断结果出现分歧时由2位及以上病理科主任医师商讨后确定最终结果，各标记物判定标准如下。

SRPX2蛋白定位于细胞膜和细胞质，首先，按照显色强度对SRPX2表达水平进行计分：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；其次，对阳性细胞百分比计分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；取两项计分之和作为最终得分，0～3分为低表达，4～12分为高表达。

HSP70定位于细胞膜和细胞质，显色强度计分方法：无染色计为0分，染色浅为1分，中等染色为2分，强染色为3分；阳性细胞百分比计分方法： ≤10%计0分，11%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。将两项得分相加，6～7分为强阳性，4～5分为阳性，2～3分为弱阳性，0～1分为阴性，最终认为弱阳性和阴性为低表达，强阳性和阳性为高表达。

MFAP2定位于细胞质，染色强度计分方法：无染色计为0分，染色浅为1分，中等染色为2分，强染色为3分；阳性细胞百分比计分方法：1%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分；取两项之和作为最终得分，>3分判定为高表达，≤3分为低表达。

4.统计学分析

使用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；定性资料采用频数和百分比表示，组间比较采用χ2检验。对单因素分析中组间差异有统计学意义的指标进行二元Logistic回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.基线临床资料的比较

148例DTC患者和120例甲状腺良性结节患者的基线临床资料及组间比较结果见表1。两组患者的性别、年龄、病灶直径和病灶位置的差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 两组患者的一般资料比较

2.分子标记物表达水平的比较

DTC组和良性结节组3种分子标记物表达水平的比较见表2。两组之间SRPX2、HSP70和MFAP2表达水平的差异均有统计学意义(P<0.01)。

表2 两组分子标记物表达水平的比较 /例

3.超声造影特征和定量参数的比较

DTC组和良性结节组超声造影特征及定量参数的比较结果间表3。两组之间增强程度和均匀性的差异均具有统计学意义(P<0.001)；DTC病灶组织的TTP、MTT和PI值均显著低于良性结节(图1)，差异均有统计学意义(P<0.001)。

图1 DTC患者，女，40岁，左侧甲状腺乳头状癌。a)常规超声图像，显示左侧甲状腺上部深层可见一低回声结节(箭)，边界不清，CDFI示周边少许点状血流信号；b)注射造影剂后11s时的左侧甲状腺超声图像，显示病灶呈不均匀低度增强(箭)；c)注射造影剂后15s时的超声图像，示病灶呈不均匀低度增强(箭)；d)病灶的TIC曲线，显示病灶相对于正常甲状腺组织呈低灌注，TTP为17s，MTT为31s，PI为14dB。

表3 两组超声造影特征和参数的比较

4.DTC组超声造影参数与分子标记物表达水平的相关性

基于DTC组TTP、MTT和PI平均值，将148例患者分为高水平组和低水平组。DTC患者超声造影特征和参数与3种分子标记物的相关性分析结果间表4～6。

表4 DTC患者超声造影特征和参数与SRPX2表达水平的关系 /例

超声造影特征和参数中增强程度、均匀性及TTP、MTT和PI水平与SPRX2表达水平具有相关性，SPRX2高表达者出现低增强、不均匀、低水平TTP、MTT、PI的比例显著高于SPRX2低表达者，差异均有统计学意义(P<0.05)。

TTP、MTT和PI水平与HSP70表达水平相关，HSP70高表达者出现低水平TTP、MTT和PI的比例显著高于HSP70低表达者，差异均有统计学意义(P<0.05)。

TTP、MTT和PI水平与MFAP2表达水平相关，MFAP2高表达者出现低水平TTP、MTT和PI的比例显著高于MFAP2低表达者，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表5 DTC患者超声造影特征和参数与HSP70表达水平的关系 /例

5.多因素分析

对DTC患者的超声造影特征和参数进行赋值(表7)。以SRPX2、HSP70和MFAP2表达水平为因变量(低表达=0；高表达=1)，以单因素分析结果中组间差异有统计学意义的变量作为自变量，进行二元Logistic回归分析，结果见表8。低水平PI和增强不均匀是SRPX2高表达的独立危险因素(P均<0.05)；低水平PI和MTT是HSP70高表达的独立危险因素(P均<0.05)；低水平TTP、MTT和PI是MFAP2高表达的独立危险因素(P均<0.05)。

表6 DTC患者超声造影特征和参数与MFAP2表达水平的关系 /例

表7 超声造影参数变量赋值

表8 超声造影特征和参数与分子标记物的Logistic分析结果

讨 论

虽然大部分DTC患者预后较好，5年生存率超过97%，但仍有少数DTC患者存在淋巴结转移和远处转移等不良预后[9-10]。因此，识别新的生物标志物，探索促进癌症进展的分子机制，对于DTC的早期诊断和个体化精准治疗至关重要。SRPX2是一种硫酸软骨素蛋白聚糖，在胃癌、食管鳞癌等多种癌症中过表达，主要作用是促进细胞增殖和转移。SRPX2可通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路参与癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转移[4]。王春梅等[7]的研究表明SRPX2在甲状腺癌病灶组织中的表达水平显著升高，并且与疾病进展和不良预后呈正相关，是甲状腺癌的预后标志物。HSP70是一种热休克蛋白，与多种肿瘤的发生、发展、耐药性和预后具有显著相关性[5]。Shibata等[4]的研究证实基于HSP70建立的评估甲状腺癌患者预后的基因模型对早期诊断甲状腺癌和预测预后具有一定价值。MFAP2是一种细胞外基质糖蛋白，在微纤维组装和组织稳态中发挥作用，与多种肿瘤的发生机制和疾病进展有关[6]。研究表明MFAP2在DTC中过表达，其表达水平的上调可诱导细胞增殖、迁移和侵袭，并抑制细胞凋亡，是DTC潜在的生物标志物和治疗靶点[3]。本研究结果亦显示，与良性结节相比，DTC病灶中SRPX2、HSP70和MFAP2的表达水平均显著升高。因此，早期通过无创性检测方式评估SRPX2、HSP70、MFAP2这些分子标志物在DTC中的表达水平，对疾病的早期诊断和预后评估具有重要参考价值。

CEUS借助造影剂观察目标组织血流灌注情况以辅助诊断组织生理病理状态，该项技术是继二维超声及彩色多普勒超声技术后的革命性飞跃[11,12]。CEUS能够反映肿瘤病灶内的微血管分布情况，而血流信号异常是肿瘤发生、发展过程中主要的病理及生理特征，因此超声造影在甲状腺结节良恶性的诊断及随访中具有重要作用[8]。本研究结果显示，DTC和良性结节的增强程度和均匀性的差异具有统计学意义，且DTC病灶组织的TTP、MTT和PI值均显著低于良性结节。这可能是由于DTC患者病灶组织的新生血管多，功能幼稚，而且血管排列杂乱、不均匀，未成熟的新生血管难以供给生长快速的癌细胞以充分的氧和营养物质等，导致癌组织处于缺血、缺氧状态，因此超声造影时表现为低增强和增强不均匀[7]。有研究表明，甲状腺癌生长具有一定异质性，癌灶浸润可破坏原有血管网络，导致血液供应局部丰富与缺乏共存，病灶局部坏死、钙化更加重了这种血管网络分布的不均衡性[13]，因此CEUS显示TDC的PI值降低。种静等[14]的研究也显示，甲状腺乳头状癌组织相较于周围正常组织表现为低增强模式，原因可能是由于病灶内部新生血管发育不良、肿瘤浸润性生长对滋养血管的破坏、以及瘤体组织常合并基质纤维化和钙化等。

此外，本研究结果表明超声造影定量参数与SRPX2、HSP70和MFAP2的表达水平显著相关。多因素Logistic回归分析结果显示，低水平PI和增强不均匀是SRPX2高表达的独立危险因素，低水平PI和MTT是HSP70高表达的独立危险因素，低水平TTP、MTT和PI是MFAP2高表达的独立危险因素。因此，本研究结果提示，超声造影参数中的TTP、MTT和PI值的降低有助于预测DTC的SRPX2、HSP70和MFAP2的表达水平。

本研究还存在一些不足之处：未测量DTC病灶中微血管数量，有待在今后的研究中进一步分析肿瘤组织的微血管密度与CEUS参数的相关性。

综上所述，超声造影参数与SRPX2、HSP70、MFAP2的表达水平有关，有助于DTC患者的早期诊断和预后评估。