三维石墨烯固相萃取液相色谱法测定结晶紫含量

黄宝美，张 梅，吴嘉欣，王 茂

(绵阳师范学院化学与化学工程学院，四川绵阳 621000)

0 引言

结晶紫是三苯甲烷染料中的一种，因其成本低、效率高而被广泛应用于水缸鱼和鱼卵中的外源真菌和寄生虫的控制[1].现代医学研究表明非法使用结晶紫会影响人体免疫系统和生殖系统.目前，欧盟、美国、中国等许多国家都要求在水产养殖中限量使用结晶紫[2].因此，建立一种检测水产品中结晶紫的高灵敏度的测定方法具有重要意义.

目前测定结晶紫的方法主要有：高效液相色谱[3]、气相色谱-质谱(GC-MS)[4]和毛细管电泳(CE)[5]等.其中灵敏度高、线性范围宽的高效液相色谱法是测定结晶紫最常用的方法.由于水产品中成分复杂，基质干扰物多，因此必须在分析检测前选择合适的样品前处理技术以分离富集样品中的目标化合物，如固相萃取[6]、磁萃取[7]、液-液微萃取(LLME)[8]和冷诱导聚集微萃取(CIAME)[9]等.

三维石墨烯(3D-GN)是碳纳米材料的胞状晶格结构，具有较大的石墨层平面，独特的二维结构和孔径分布.其比表面积可高达2 630 m2/g，具有良好的化学稳定性、机械性能和非常高的吸附能力，是最有潜力的吸附材料之一，在水吸附和净化处理方面具有良好的应用前景[10]，能更有效地去除水污染物中的结晶紫.本文以3D-GN为固相萃取剂，利用高效液相色谱-固相萃取联用技术对鱼样中结晶紫残留量的检测进行了研究，该方法原理简单，测定速度快，方便操作，为大规模检测提供方法参考.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津科技有限公司)，包括LC-20AT型高压双泵、SIL-20A自动进样阀、SPD-20AT紫外-可见检测器、CTO-20A柱箱、LCsolution色谱数据工作站和IBM台式电脑；JSM-6460F扫描电子显微镜(SEM)(日本电子株式会社)；透射电子显微镜(TEM)(德国布鲁克公司)；傅里叶变换红外光谱仪(美国布鲁克仪器公司).

结晶紫(天津凯密化学试剂有限公司);纯度大于99.85%的石墨粉(上海华谊集团公司).所有其他化学品均为分析试剂级.实验用水为纯水.本实验是在室温下进行的.

1.2 高效液相色谱条件

C18色谱柱柱(粒径5 μm，内径250 mm×4.6 mm)；流速为0.5 mL·min-1，注射量为10 μL；流动相为乙酸铵(溶剂B)和乙腈(溶剂A，pH=4.5)；A/B比值保持在20/80(v/v)；结晶紫检测波长为588 nm.

1.3 3D-GN的制备

1.3.1 氧化石墨烯(GO)的制备 根据改进的Hummers制备GO[11].具体步骤如下：冰水浴条件下，将1 g片状石墨粉和1 g NaNO3粉加入装有70 mL H2SO4的三颈反应瓶中.在磁力搅拌器的作用下，缓慢加入6 g KMnO4粉末(T≈5 ℃)，控制反应温度反应2 h.冰水浴变为温水浴时，保持温度35 ℃下，接下来将100 mL二次蒸馏水缓慢多次加入，并控制温度在100 ℃以下，保持30 min，加入5 mL 30%的H2O2除去未反应的KMnO4，45 min后，再加入60 mL二次蒸馏水，反应10 min.溶液颜色变为亮黄色时趁热过滤，用10%稀盐酸和二次蒸馏水洗涤.将超声分散6 h后的下层沉淀液在转速3 000 r·min-1离心30 min，下层胶液在10 000 r·min-1离心40 min.最后将下层胶液在50 ℃真空干燥箱中充分干燥2-3天，得到GO产品.

1.3.2 3D-GN的制备 称取100 mg GO，分散在200 mL水溶液中.取0.5 g·L-1的棕黄溶液，用超声波清洗机清洗1 h，得到稳定的分散悬液.将所得悬浮液放入80 ℃的温水浴中.然后准确称取1.0 g硼氢化钠，溶解于蒸馏水中，滴入反应体系.将反应1 h的还原产物在60 ℃的真空干燥箱中沉淀，得到3D-GN样品.

1.4 鱼样的处理

校园街市购买的鱼样处理捣碎.称取该鱼样10.00 g加入装有3 mL盐酸羟胺溶液，5 mL对甲苯磺酸溶液和10 mL醋酸缓冲液的100 mL烧杯中，转入匀浆器加10.00 mL乙腈搅拌1 min，再加入酸性10 g Al2O3搅拌1 min.然后将该溶液在转速3 000 r·min-1下离心10 min.最后把离心液转移到含有4 mL二甘醇，20 mL水和20 mL乙腈的100 mL加塞的离心管.接下来对鱼样进行净化处理，将30 mL二氯甲烷在3 000 r·min-1的速度下离心10 min，2次.收集离心液于50 ℃加热蒸发至干燥，用2.5 mL乙腈溶解，再次蒸发至接近干燥，以1 mL流动相准确溶解残液，将残液过0.45 μm滤膜后用高效液相色谱法测定[12].

1.5 3D-GN用于结晶紫的富集流程

分别量取50 mL空白鱼样品(经1.4处理后未加石墨烯的鱼样品)和标准鱼样品溶液(在空白鱼样品中加入结晶紫标准溶液至结晶紫浓度为1.5 μg·mL-1)，各装入100 mL锥形瓶中并调节pH=7，并将两个锥形瓶内的溶液都进行如下操作.即向锥形瓶加入60 mg 3D-GN，再加入1 mL丙酮振荡分析5 min，然后保持30 ℃恒温振动吸收3 h，重复3次.将锥形瓶所得的洗脱液合并，蒸发至接近干燥，用1 mL流动相溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤.最后取10 μL滤液进行高效液相色谱分析.

2 结果与讨论

2.1 3D-GN的表征

2.1.1 TEM和SEM表征 图1(a)(b)为GO的TEM和SEM图，(c)(d)为3D-GN不同放大倍数下的SEM图.从图1(a)(b)可以看到，GO表面光滑透明，状态蓬松，有褶皱、卷曲和团聚现象.由(c)(d)可以看出，3D-GN样品透明，出现褶皱状起伏，卷曲度较大.

图1 GO的TEM图(a)；GO的3000倍SEM图(b)；3D-GN的5000倍SEM图(c)；3D-GN的30000倍的SEM图(d)Fig.1 The TEM diagram of GO(a);The SEM diagram of3000 times of GO(b);The SEM diagram of 5000 times of3D-GN(c);The SEM diagram of 30000 times of 3D-GN(d)

2.1.2 红外光谱表征 GO和3D-GN的红外光谱如图2所示.A为GO的红外光谱，从图中曲线可知，1 392 cm-1，3 450 cm-1处为O-H(羟基)的面内变形振动特征峰和变形膨胀振动吸收峰，1 724 cm-1为C=O(羰基)的伸缩振动吸收峰，1 052 cm-1和1 221 cm-1分别代表GO的C-O-C烷氧基和烷基代表的振动吸收峰，1 620 cm-1处说明GO的C=C的拉伸振动特征峰较羰基弱.上述结果表明本实验制备的GO至少含有羟基、烷基、羰基、烷氧基和C=C官能团.3D-GN的红外光谱如B所示，1 700 cm-1处的吸收峰属于氧官能团C=O的伸缩振动.同时环氧C-O(约1 200 cm-1)和烷氧基C-O(约1 000 cm-1)的伸缩振动峰明显减少，而C=C的吸收明显，说明实验制备的3D-GN产品性能良好.

图2 GO和3D-GN的红外光谱图Fig.2 FT-IR of GO and 3D-GN

2.2 色谱分析及标准曲线 本实验鱼样品未检测出CV

在最优实验条件下，1.5 μg·mL-1结晶紫标准液的色谱图见图3(A)，添加1.5 μg·mL-1标准结晶紫的鱼样(B)，鱼样B经3D-GN富集的色谱图(C),(D)为结晶紫溶液定量分析标准曲线.

图3 1.5 μg·mL-1结晶紫标准工作液下的液相色谱图(A)；添加1.50 μg·mL-1结晶紫标准溶液后的鱼样的色谱图(B);添加1.50 μg·mL-1结晶紫标准溶液的鱼样经3D-GN富集后的色谱图(C)；结晶紫溶液定量分析标准曲线(D)；Fig.3 The chromatogram of standard CV working solutionat 1.5 μg·mL-1；The chromatogram offish sample added with 1.50 μg·mL-1 standard CV(B);The chromatogram of fish sample added with 1.50 μg·mL-1standard CV after enrichment with 3D-GN(C); Calibration curve for quantitative analysis of CV(D);

从图3(B)中可以看出，加标鱼样品(在空白鱼样品中加入结晶紫标准溶液至结晶紫浓度为1.5 μg·mL-1)峰高为20 mAu.而添加1.50 μg·mL-1标准结晶紫的鱼样品经3D-GN富集后的结晶紫峰高达1 280 mAu，如图3(C)所示.计算可得，3D-GN富集倍数为64，说明样品经富集后能大大提高结晶紫检测的灵敏度.

按试验方法对0.015，0.01，0.05，1.0，5.0，10，30和50 μg·mL-1的结晶紫溶液在色谱条件下进行测定，定量分析标准曲线见图3(D).根据实验结果分析，结晶紫浓度(x)在0.015～50 μg·mL-1范围内与其峰高呈良好线性关系(R2=0.999 0)，线性回归方程为y=42.04x-9.167，检出限为5×10-5μg·mL-1.

查找文献对比本文方法与其他不同前处理方法在检出限、采用的色谱柱以及回收率三方面对比，结果如表1所示.

表1 本文的方法与其他前处理方法测定CV的检出限比较Tab.1 Comparison of the LODs of the present method with otherpretreatment methods for HPLC determination of CV

2.3 方法回收率和重现性

取空白鱼样品若干份，分别加入浓度为1 μg·mL-1、2 μg·mL-1和5 μg·mL-1的标准溶液.按试验方法平行测定，计算回收率和相对标准偏差，结果见表2.

通过实验进行了稳定性和重现性的考察，连续测定6次，回收率在92%-97%之间，相对标准偏差(RSD)小于2%，说明该实验测试稳定性良好.日内分析的相对标准偏差(RSD)为1.6%，日间分析的相对标准偏差(RSD)为2.1%，说明重现性良好.

3 结论

本实验制备了3D-GN固相萃取剂，并建立了固相萃取-高效液相色谱法测定水产品中的痕量结晶紫的方法.该方法能准确高效快速检测水产品中结晶紫的含量，操作简便、高效且灵敏度较一般方法高，加标回收率以及重复性实验符合分析要求，可为水产品中结晶紫痕量测定提供科学的方法.