糖尿病对肺结核菌株表型耐药及基因突变影响的前瞻性研究

张瑛梅，王飞，任小兵，王玥莲，陈俊，胡莹，胡晓勤，徐文革*

我国是结核病和糖尿病高负担国家［1］，耐药结核病（drug resistant tuberculosis，DR-TB）是当前全球健康的一个严重威胁，其发病率、病死率高，治疗复杂，花费巨大［2］，是人类战胜结核病的重大阻碍。临床上糖尿病合并肺结核很常见。近年来，国内外在糖尿病对肺结核耐药率、疗效差异、复发率等方面有一些临床研究，但结论并不统一［3-4］。有研究发现合并糖尿病的肺结核（DM-PTB）比单纯肺结核（PTB）有更高的异烟肼耐药率，但利福平耐药无差异［5］，也有研究表明DM-PTB的耐药率与PTB无差异［6］。国外有研究发现DM-PTB患者异烟肼、利福平和吡嗪酰胺的耐药率较高，相较于PTB更有可能出现耐多药结核病［7］。通过查阅文献发现，既往研究多以回顾性研究为主，糖尿病对肺结核菌株表型耐药、基因突变影响的前瞻性对比研究尚少。为进一步探究糖尿病对肺结核耐药的影响，本研究前瞻性地对DM-PTB及PTB患者进行表型耐药、基因突变检测，旨在为后续研究提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018—2020年在简阳市人民医院就诊的结核分枝杆菌培养阳性的肺结核患者357例，根据是否合并糖尿病，将其分为PTB组216例和DMPTB组141例。本研究通过简阳市人民医院伦理委员会伦理审核〔编号：（2018）19〕，已在中国临床试验注册中心注册，注册号：ChiCTR2000039148。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：符合《肺结核诊断：WS 288—2017》中的涂片阳性肺结核诊断标准［8］；符合《中国慢性疾病防治基层医生诊疗手册（糖尿病分册）2015年版》中的糖尿病诊断标准［9］：有糖尿病典型症状，空腹静脉血糖＞7.0 mmol/L，随机或空腹葡萄糖耐量试验（OGTT）2 h静脉血糖＞11.1 mmol/L；若无症状，需非同日2次检测明确。排除标准：菌种鉴定为非结核分枝杆菌。

1.3 材料与方法 试剂及设备：结核分枝杆菌菌种鉴定采用美国BD公司BACTEC MGIT960 System全自动分枝杆菌培养系统。采用异烟肼、乙胺丁醇、利福平、链霉素药敏试剂盒（荧光法）进行表型药物敏感试验（简称：药敏试验）。分子检测试剂：结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂盒（PCR-反向点杂交法），由亚能生物技术（深圳）有限公司提供；伯乐基因扩增仪（仪器型号S1000）。

1.4 试验方法 从门诊、住院的患者中筛查痰抗酸染色阳性患者，记录患者年龄、性别、是否合并糖尿病，取晨痰送结核分枝杆菌培养进行菌株鉴定。培养为阳性且鉴定为结核分枝杆菌的标本继续进行药敏试验。PTB组随机抽样选择62例、DM-PTB组随机选择61例进行耐药基因位点突变检测，检测位点包括异烟肼inhA基因-15位碱基、KatG基因315位氨基酸；利福平rpoB基因RRDR区、rpoB基因516位氨基酸、rpoB基因526位氨基酸、rpoB基因531位氨基酸；乙胺丁醇embB基因306位氨基酸；链霉素rpsL基因43位氨基酸、rpsL基因88位氨基酸。

1.5 耐药定义 根据《耐药结核病化学治疗指南（2019年简版）》［10］定义，单耐药结核病：结核病患者感染的结核分枝杆菌经体外药敏试验被证实对一种一线抗结核药物耐药。多耐药结核病：结核病患者感染的结核分枝杆菌经体外药敏试验被证实对一种以上一线抗结核药物耐药（但不包括同时对异烟肼、利福平耐药）。耐多药结核病（MDR-TB）：结核病患者感染的结核分枝杆菌经体外药敏试验被证实至少同时对异烟肼和利福平耐药。

1.6 统计学方法 采用SPSS 25.0软件包进行统计学分析，计量资料进行正态分布检验，偏态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用非参数检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验或Fisher's确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 患者入组流程见图1。PTB组男162例，女54例；中位年龄52（34，65）岁。DM-PTB组男124例，女17例；中位年龄53（39，61）岁。两组年龄比较，差异无统计学意义（Z=-1.78，P=0.07）。两组性别比较，差异有统计学意义（χ2=8.97，P=0.003）。

图1 患者入组流程图Figure 1 Flowchart of participants enrollment

2.2 抗结核药耐药及基因位点突变情况

2.2.1 一线药物耐药结果 两组利福平、乙胺丁醇、链霉素耐药率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；DM-PTB组异烟肼耐药率高于PTB组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 PTB组和DM-PTB组患者一线抗结核药物耐药率比较〔n（%）〕Table 1 First-line drug-resistant profile between pulmonary tuberculosis patients with and without diabetes

2.2.2 不同类型耐药结果 两组患者异烟肼、利福平、链霉素单耐药率以及多耐药率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；DM-PTB组耐多药率高于PTB组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 PTB组和DM-PTB组患者不同类型耐药情况比较〔n（%）〕Table 2 Different types of drug resistance between pulmonary tuberculosis patients with and without diabetes

2.2.3 检测基因位点突变结果 两组患者检测基因位点突变率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 PTB组和DM-PTB组患者检测基因位点突变率比较〔n（%）〕Table 3 Rate of mutation at the gene loci between pulmonary tuberculosis patients with and without diabetes

2.2.4 一线抗结核药耐药基因位点突变分布 PTB组异烟肼耐药位点均为KatG基因315位氨基酸S315T/N位点突变5例（5/5）；利福平耐药位点为rpoB基因RRDR区6例（6/15），rpoB基因526位氨基酸H526D位点突变4例（4/15），rpoB基因531位氨基酸S531L位点突变5例（5/15）；链霉素耐药位点rpsL基因43位氨基酸K43R位点突变2例（2/3），rpsL基因88位氨基酸K88R位点突变1例（1/3）。

DM-PTB组异烟肼耐药位点均为KatG基因315位氨基酸S315T/N位点突变7例（7/7）；利福平耐药位点为rpB基因RRDR区3例（3/5），rpoB基因531位氨基酸S531L位点突变2例（2/5）；乙胺丁醇耐药位点为embB基因306位氨基酸M306L/V位点突变1例（1/1）。

3 讨论

世界卫生组织指出，糖尿病是结核病发生的重要风险因素［1］。免疫和激素的变化、不同细胞因子的产生、微生物群的改变、内皮功能障碍和维生素D缺乏是导致2型糖尿病和肺结核共病的主要因素［11］。合并糖尿病同样也会增加耐药风险，国内一项纳入13项研究、33 747例患者的Meta分析结果显示，在新诊断的结核病患者中，糖尿病与异烟肼耐药性显著相关〔RR=1.22，95%CI（1.04，1.43）〕［12］。另一项研究发现，糖尿病病程≥5年是发生耐多药的危险因素（OR=19.469，P=0.015）［13］。糖尿病和结核病重叠可能会对全球结核病防控工作产生不利影响［14］，国外研究也证实合并糖尿病的新发结核病患者耐药风险增加［15］。糖化血红蛋白（HbA1c）＜7%的DM-PTB患者发生利福平耐药、异烟肼耐药和耐多药风险更低［16］。本研究通过对PTB组患者及DM-PTB组患者进行前瞻性的基因突变、表型耐药检测，证实糖尿病会提高肺结核的异烟肼耐药率及耐多药率，但是对利福平、乙胺丁醇、链霉素的耐药率无差异。

结核分枝杆菌耐药的主要原因是基因突变［15］，已有研究证实结核分枝杆菌耐利福平rboB基因位点突变主要与531位点、526位点高度相关，耐异烟肼katG315位点、inhA基因-15位点突变与异烟肼耐药高度相关，提示利福平和异烟肼敏感性的基因型与这些药物的表型耐药性高度相关［17］。katG、rpoB、rpsL基因突变检测能有效预测异烟肼、利福平、链霉素耐药［18］。本研究选择inhA基因-15位碱基、KatG基因315位氨基酸、rpoB基因RRDR区、rpoB基因516位氨基酸、rpoB基因526位氨基酸、rpoB基因531位氨基酸、embB基因306位氨基酸、rpsL基因43位氨基酸、rpsL基因88位氨基酸能有效预测异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素一线药物的耐药。通过研究发现，异烟肼突变率第1位的基因位点为：katG315，与前期研究结果一致［19］。同时研究发现无论是PTB还是DM-PTB患者，均以KatG基因315位氨基酸为主，突变类型为S315T/N。利福平耐药位点突变分布有一定差别，DM-PTB患者利福平耐药位点主要为rpoB基因RRDR区、rpoB基因531位氨基酸，耐药位点与徐小溪等［20］研究相似。本研究PTB患者耐药位点除上述位点外，还发现有rpoB基因526位氨基酸突变，提示利福平耐药位点突变可能存在多态性。乙胺丁醇耐药相关基因突变以embB基因306位氨基酸突变为主，突变类型为M306L/V。链霉素耐药相关基因突变主要以rpsL基因43位氨基酸K43R位点突变为主。本研究结果提示PTB患者及DM-PTB患者之间各一线抗结核药物相关耐药基因位点突变分布及突变率无统计学差异，这与国内其他研究有一定区别［5］。

本研究进行了以药敏试验作为结果的表型耐药研究及以基因位点突变结果的耐药位点研究，发现简阳地区的耐药率与其他地方的检测结果有一定差异［21］。这与地域差异及医疗分布有关，简阳市人民医院作为县级市三甲医院，主要收治来自基层初筛怀疑结核的患者，患者主要以初治结核为主。另外，从培养和基因检测结果对比发现，基因位点突变与表型耐药之间并不完全对等，本研究检测的位点突变率低于药敏试验结果，这可能与基因检测样本相对偏少有关，也可能提示表型耐药的患者不一定伴随相应药物耐药位点的突变。临床的最终治疗应以药物敏感试验结果为准，同时需密切观察患者抗结核治疗后的应答情况。

另外，本研究发现，DM-PTB患者中男性所占比例较高，与吴桂辉等［22］、李雪等［23］研究相似，提示应该重视男性糖尿病群体中肺结核的排查以及男性肺结核患者中糖尿病的筛查。

综上所述，本研究证实糖尿病会加重肺结核患者异烟肼耐药及耐多药情况的出现，从而加重耐药结核负担。临床工作中应该加强对DM-PTB患者的耐药筛查，尤其是抗结核治疗效果欠佳的患者，同时要强化血糖的控制。

本研究也存在一些不足之处：入组患者多为初治患者，但也有个别是再发、复治患者，未进行区分，结果可能会有一定偏倚，可以在以后更大样本量的研究中优化。另外，本研究尝试通过基因位点突变间的差异探索对于糖尿病影响异烟肼耐药的具体机制，但未发现两组患者基因位点间存在差异，考虑可能与基因位点监测样本偏少，得出的耐药数量、耐药率相对偏低有一定关系。以上不足与未探明的机制也将是下一步研究的重点。

作者贡献：张瑛梅提出研究思路、设计研究方案、负责数据收集、统计学分析、绘制图表、论文起草以及最终版本修订，对论文负责；王飞设计研究方案、进行论文的修订；任小兵负责文章修改；王玥莲负责数据收集；陈俊、胡莹、胡晓勤负责样本的采集；徐文革负责最终版本修订，对论文负责。

本文无利益冲突。