基于线粒体D-loop 区的广东沿岸和三沙海域绿海龟遗传多样性分析

陈华灵，叶明彬，谢子强，肖宝华，廖宝林，王付民，王少锋，姜怡薇

(1.广东惠东海龟国家级自然保护区管理局，广东惠州 516359；2.广东海洋大学深圳研究院，广东深圳 518108；3.深圳市碧海蓝天海洋科技有限公司，广东深圳 518108)

绿海龟Chelonia mydas是一种古老的海洋生物，分布在热带和亚热带海域，是最常见的海龟种类[1]。研究指出，在自然环境中绿海龟具有强烈的产卵洄游特性，成年雌性海龟会准确地找回其出生地并进行繁殖产卵活动[2-3]。随着时间的推移，种群之间会产生强烈的遗传差异，尤其是在母系遗传的线粒体基因(mtDNA)上[4]。随着分子标记技术的发展，分子标记技术广泛应用于海洋生物的种群遗传结构和遗传多样性分析[5-6]。国外学者也通过相关分子标记技术开展了绿海龟种群结构、联通性和区域系统地理学等研究。20世纪90 年代，BOWEN,et al[2]通过研究绿海龟线粒体基因型提出，绿海龟种群有2 个主要的地理种群，一个为大西洋-地中海地理种群，另一个为印度-太平洋地理种群。此后，许多学者对大西洋、地中海、印度洋、西太平洋、中太平洋和东太平洋等相对较小距离上的绿海龟的地理谱系和种群结构进行研究，并表明在不同海区的绿海龟种群中，有限的基因流动与偶然的长距离扩散事件是一种常见的现象[7-10]。

绿海龟是在我国分布的5 种海龟中种群数量最多的物种，也是唯一一种在我国华南沿岸筑巢产卵的海龟，从我国山东到南海海域均有分布，现为我国一级保护动物[11-13]。由于受到渔业捕获、非法贸易、产卵地生境破坏和海洋污染等威胁，我国绿海龟种群在过去几十年中严重衰退[11]。因此了解我国绿海龟种质资源和遗传多样性现状是开展绿海龟种群保护和开展人工繁育的必要理论基础。近年来，国内包括香港、台湾地区的学者纷纷对我国绿海龟种群结构及其遗传多样性开展调查研究。杨文嘉[14]利用D-loop 在内的多种分子标记对中国南海海域的175 只绿海龟遗传多样性进行了遗传多样性研究，初步探究了我国南海绿海龟种群遗传结构。魏文芝[11]采取问卷调查、实地调查和线粒体DNA 分子标记技术对中国南海绿海龟资源进行研究，结果显示我国南海海域的绿海龟种群具有较高水平的遗传多样性。香港城市大学NG,et al[13]采集来自香港、广东和台湾海域的110 只绿海龟样品，获取了线粒体DNA 控制区的基因序列和单倍型信息，对其繁殖种群的遗传多样性进行了探究，并与整个东太平洋和东南亚海域的绿海龟种群联系进行了分析和讨论。

广东惠东海龟国家级自然保护区是目前我国大陆近岸唯一的绿海龟产卵地，自20 世纪80 年代成立保护区以来，开展了大量的绿海龟种质资源保护工作，并在国内首次人工繁育出绿海龟子代[15-16]。近10 年来，国内虽然已有基于分子标记的南海绿海龟生物多样性研究报道[13-14]，但仅集中于较小范围内的地理种群研究。本研究利用D-loop 序列部分片段作为分子标记，对广东惠东海龟国家级自然保护区、粤西海域和海南三沙海域绿海龟群体的遗传多样性进行比对，为探究我国绿海龟种群遗传多样性和开展绿海龟种质资源保护奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集与基因组总DNA 的提取

本研究所采集的绿海龟的组织样本均来自广东惠东海龟国家级自然保护区救护或洄游产卵孵化的野生绿海龟，其中包括从海南三沙(七连屿)海域救护绿海龟样本25 个(编号S)、广东粤西(硇洲岛、东海岛至徐闻一带)海域救护的绿海龟样本26 个(编号I)、广东惠东海龟国家级自然保护区(巽寮湾、平海和港口)海域救护或洄游绿海龟产卵孵化的绿海龟样本81 个(编号X)，共计132 个样本。采集样品的绿海龟均为活体，剪取绿海龟前肢量上皮组织并保存在无水乙醇中，用安多福溶液对伤口消毒处理。记录样品编号及对应的电子芯片号，用北京擎科生物科技有限公司生产的动物基因组DNA 提取试剂盒(TSP201-200)提取海龟DNA，并置于-20 ℃保存备用。

1.2 PCR 扩增与测序分析

D-loop 基因的PCR 引物参照NORMAN,et al[17]的研究。上下游引物序列分别为TCR-5：TTGTACATC TACTTATTTACCAC(5′-3′)和TCR-6：GTAAGTAAAACTACCGTATGCCAGGTTA(5′-3′)。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR 反应体系的反应总体积50 μL：1.1×T3 Super PCR Mix(擎科生物)47 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL。PCR 反应条件：98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共30 个循环，最后72 ℃延伸5 min。将扩增好的PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳(2 μL 样品+6 μL溴酚蓝)，300 V 电压下12 min，获取鉴定胶图，通过胶图确定扩增条件是否单一，是否弥散，有无非特异性条带。选取扩增质量较高的PCR 产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，获得测序峰图和碱基序列。

1.3 序列分析

测序获得的碱基序列使用MEGA 6.0 软件统计序列的碱基组成与含量、碱基信息位点数量，计算遗传距离，并构建基于K2-P 的邻位连接(neighbor-joining,NJ)系统发育树。采用DnaSP 5.10 软件统计变异位点位置，单倍型分布等，采用Arlequin 3.1 软件计算Fst值、Nm值、Tajima′s D 和Fu′s Fs中性检验以及进行AMOVA 分析。应用DNAsp 软件与PopART 1.7 软件单倍型中介连接网络(median-joining)分析。

2 结果与分析

2.1 序列多态性分析

本研究扩增获得了132 条D-loop 基因序列，排序去除两端冗余序列后得到碱基片段在336～388 bp之间，绝大部分的碱基片段在384 bp 以上。在这132 条D-loop 基因序列中T、C、A 和G 碱基的平均含量分别为35.6%、14.4%、32.6%、17.4%，其中A+T 含量(68.2%)明显高于C+G 含量(31.8%)，碱基组成具有明显的偏向性(表1)。

表1 3 个地理群体D-loop 基因片段的碱基组成比例Tab.1 The nucleotide percentage composition of the D-loop fragments in 3 populations

2.2 群体遗传多样性及单倍型分析

在132 条D-loop 基因序列中，共检测出32 个变异位点，总单倍型多样性为0.779，总核苷酸多样性为0.007 55；各群体的单倍型多样性(Hd)在0.157～0.775 之间，核苷酸多样性(π)在0.000 63～0.010 17 之间(表2)。根据GRANT,et al[18]的研究报道，种群单倍型多样性及核苷酸多样性临界值分别为0.5 和0.005，二者的值越大，群体的多样性程度越高。本研究的三沙地理群体(S)内的单倍型多样性和核苷酸多样性均未超过临界值，表明其群体内的遗传多样性程度较低；粤西地理群体(I)的单倍型多样性大于0.5，而核苷酸多样性小于0.005，表明其群体内遗传多样性程度一般；广东惠东国家级海龟保护区群体(X)的单倍型多样性和核苷酸多样性均超过临界值，表明其群体内的遗传多样性程度较高。以132 个样本为1 个总群体来算，其种群单倍型多样性和核苷酸多样性均超临界值，总群体的遗传多样性程度较高。

表2 3 个绿海龟群体D-loop 基因的遗传多样性指数Tab.2 Genetic diversity index based on D-loop sequences of 3 populations in C.mydas

在132 条D-loop 基因序列中共检测出19 个单倍型，其中共享单倍型有7 个(Hap_1、Hap_3、Hap_4、Hap_5、Hap_6、Hap_7 和Hap_9)。从单倍型网络图(图1)可以看出，Hap_3 和Hap_5 作为中心向其他单倍型发散，其单倍型出现的频率也是最高的2 个，分别为31.06%和33.33%。各单倍型之间的突变步数1～14 步不等。三沙地理群体(S)包含了Hap_4、Hap_5 和Hap_10 这3 种单倍型，粤西地理群体(I)包含了Hap_1、Hap_3、Hap_4、Hap_5、Hap_6、Hap_7、Hap_8 和Hap_9 这8 种单倍型，广东惠东国家级海龟保护区群体(X)包含了除Hap_4、Hap_8 和Hap_10 之外的所有16 种单倍型。通过在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)上进行的序列比对，并查阅DUTTON，et al[19]、JENSEN，et al[20]和杨文嘉[14]有关印度-太平洋地区绿海龟单倍型分类研究的结果，本研究获得的单倍型对应的相同的序列及对应的单倍型如表3 所示。其中Hap_10、Hap_14 以及Hap_19 这3 个单倍型在NCBI 上比对不到完全相同的序列。Hap_18 的单倍型序列与杨文嘉的研究报道中CmC8 一致，其余的15 种单倍型序列信息与DUTTON,et al[19]和JENSEN,et al[20]的研究报道中的相关15 种单倍型信息一致。

表3 19 个绿海龟单倍型与其他学者研究对比情况Tab.3 The 19 haplotypes of C.mydas were compared with other studies

图1 基于D-loop 基因序列的3 个绿海龟群体单倍型网络中介图Fig.1 Median-joining network based on D-loop sequences of 3 populations in C.mydas

2.3 遗传分化和基因流

从群体间的遗传分化结果（表4）可以看出，S 和I 群体间的Fst值最大，S 和X 群体间的Fst值其次、且大于0.15，I 和X 间的Fst值最小、且小于0.05。群体遗传分化系数(Fst)是一个衡量群体间遗传分化程度的参数：Fst＜0.05 表示分化较小，0.05＜Fst＜0.15 表示中等分化，0.15＜Fst＜0.25 表示高度分化，0.25＜Fst＜1.00 表示极高度分化[21]。基因流Nm值显示S、I、X 这3 个群体之间存在基因交流现象。从3 个群体的种群AMOVA 分子变异结果分析，群体的遗传变异主要来自群体内，占比达到88.3%，群体内的占比仅为11.7%(表5)。本研究3 个群体间存在一定的分化，三沙群体和其他2 个群体存在高度的分化，粤西群体和海龟保护区群体存在较小的分化。

表4 基于D-loop 基因的群体间Fst(对角线下)和Nm 值(对角线上)Tab.4 The Fst and Nm value based on D-loop sequences

表5 3 个群体D-loop 序列的种群AMOVA 分析Tab.5 The AMOVA analysis of D-loop sequences in 3 populations

2.4 基于Tajima′s D 和Fu′s Fs 的绿海龟群体中性检测分析

从3 个绿海龟群体的Tajima′sD和Fu′sFs中性检测分析结果来看(表6)，3 个群体的Tajima′sD和Fu′sFs中性检测D值均为负值，三沙地理群体(S)的Tajima′sD和Fu′sFs中性检测P值均小于0.05，粤西地理群体(I)的Tajima′sD的P值大于0.05 而Fu′sFs的P值大于0.05，广东惠东国家级海龟保护区群体(X)的Tajima′sD和Fu′sFs中性检测P值均大于0.05。Tajima′sD和Fu′sFs中性检测结果说明三沙群体可能经历过快速种群扩张。

表6 3 个绿海龟群体的Tajima′s D 和Fu′s Fs 中性检测值Tab.6 Neutrality tests of 3 populations in C.mydas

2.5 基于D-loop 序列片段对绿海龟群体和单倍型的系统进化分析

以棱皮龟Dermochelys coriacea作为外源种(GenBank 序列号：AF121964.1)，采用邻位连接法(neighborjoining,NJ)构建3 个绿海龟地理群体共的D-loop 系统发育树(图2)。结果显示3 个群体的绿海龟存在较为复杂的交叉聚类现象。132 个样本的系统发育树主要分为3 个大的分支，其中第1 大分支包含了3 个群体共125 个样本，第2 大分支包含了广东惠东国家级海龟保护区群体(X)的6 个样本，第3 个分支仅含有广东惠东国家级海龟保护区群体(X)的1 个样本。同时根据19 个单倍型的D-loop 序列和棱皮龟的序列采用邻位连接法构建了单倍型的系统发育树(图3)，单倍型的系统发育树的聚类情况也与132 个样本的系统发育树的结果相互对应，一共分为3 大分支，其中Hap_11 单独为一支(分支Ⅲ)，Hap_2、Hap_15、Hap_16 和Hap_17 聚为分支II，其余的14 个单倍型聚为分支I。

图2 利用132 个样品的D-loop 序列数据构建的分子系统进化NJ树Fig.2 The neighbor-joining tree constructed with D-loop gene sequence of 132 samples

图3 利用19 个单倍型D-loop 序列数据构建的分子系统进化NJ树Fig.3 The neighbor-joining tree constructed with D-loop gene sequence of 19 haplotypes

3 讨论

物种群体遗传多样性是评估地理区域内物种种质资源丰富度和现状的重要指标，也是开展物种保护和人工繁育的基础[21-22]。本研究通过检测群体单倍型数量、单倍型多样性和核苷酸多样性3 个指标来对3个绿海龟地理群体的遗传多样性进行评估分析。其中3 个绿海龟地理群体132 个样本共定义了19 个单倍型，其中三沙、粤西和惠东海龟保护区的群体单倍型数量分别为3、7 和16 个，总单倍型多样性为0.779，总核苷酸多样性为0.007 55。NG,et al[13]在香港、广东惠东海龟保护区和台湾海域共采集110 只绿海龟并检测出27 个单倍型，其中广东惠州海龟国家级自然保护区检测出CmP19 和CmP49 2 种单倍型；魏文芝[11]对采集于三沙的51 个野生绿海龟样品的D-loop 序列进行分析，共定义了14 个单倍型，总单倍型多样性为0.818，总核苷酸多样性为0.007 72。杨文嘉[14]对采集于海南岛附近的绿海龟样本进行D-loop 序列扩增，获得91 个D-loop 序列共定义了8 个单倍型，总单倍型多样性为0.45，总核苷酸多样性为0.003 5。JENSEN曾研究了全球4 878 只海龟的遗传多样性，共统计出144 种单倍型，群体平均单倍型多样性为0.420，平均核苷酸多样性为0.009 3[20]。综合国内的相关报道，地处西太平洋的华南沿岸和南海海域的绿海龟群体，单倍型多样性水平高于全球平均值，具有较高的生物多样性水平。

目前，主流的绿海龟系统演化观点仍遵循着20 世纪末BOWEN,et al[2]提出的2 大地理种群学说，并由后续全球各地区学者对较小地理区域的种群结构和谱系进行深入研究。但由于缺乏对D-loop 单倍型命名的标准协议，全球已报道的绿海龟D-loop 单倍型就有700 多个，其中出现了大量的重复现象[20]。因此为了方便我们研究对比讨论，本研究主要以DUTTON,et al[19]和JENSEN,et al[20]的研究报道中以CmP 命名的印度-太平洋种群的单倍型数据作为参考。JENSEN,et al[20]通过收集全球127 个产卵地的4 878 个绿海龟样本的mtDNA 数据集，对种群的联通性和基因流动障碍进行了深入的研究，并通过D-loop 序列在2 大地理种群的基础上细分了11 个绿海龟线粒体DNA 分支谱系。本研究的3 个群体的19 个单倍型，其构建的系统进化树的3 大分支与JENSEN,et al[20]研究成果中的Ⅲ、Ⅶ和Ⅷ这3 个分支谱系是相互契合的。而在JENSEN,et al[20]的研究报道中，本研究对应相同的单倍型包含了西太平洋中部、西太平洋南部、日本、印度-太平洋、西南印度洋、西北印度洋等不同地理区域的绿海龟个体，也从侧面说明华南沿岸和南海海域这个较小地理范围内的绿海龟与整个印度-太平洋大区的绿海龟具有种群连通性。

不同群体间的遗传分化系数Fst值和基因流Nm值反映了其分化状况的程度,但国内对我国南海海域和华南沿岸两大区域内的绿海龟遗传分化方面的研究仍鲜有报道。本研究的3 个地理群体间存在一定的遗传分化现象，三沙和粤西2 个野生地理群体与广东惠东海龟国家级自然保护区群体之间的Fst值分别为0.171 7 和0.043 4，三沙地理群体与粤西地理群体之间的Fst值为0.194 8。南海海域的绿海龟群体与华南沿岸绿海龟群体的Fst值均大于0.15，属于高度分化的水平。由于绿海龟是一种洄游性海洋生物，在觅食、繁殖和海流等因素作用下，其迁徙活动的范围十分广袤。叶明彬等[23]采用卫星追踪的手段对惠东幼年海龟的洄游规律及觅食地选择进行研究，发现在惠东产卵的海龟在东海和南海之间作季节性定向洄游，觅食活动足迹主要沿我国华南沿岸一直到粤西再到越南沿岸。本研究的遗传分化结果也侧面说明了粤西地区由于地处惠东海龟洄游路线上，其地理群体与惠东海龟保护区群体存在更近的亲缘关系。

我国华南沿岸和南海海域是位于整个西太平洋绿海龟地理活动的焦点位置，是西北太平洋、西南太平洋、中太平洋等多个地理谱系绿海龟洄游的交界区域，从遗传育种的角度看，在该地区开展绿海龟的遗传杂交育种有利于提升本地区海龟品种的遗传多样性水平。近年来，广东惠东海龟国家级自然保护区开展了大量绿海龟人工繁育的技术研究，并在国内首次全人工繁育出绿海龟子代[15-16]。本研究的绿海龟总体样本具有较高的遗传多样性水平，尤其是广东惠东绿海龟保护区圈养的绿海龟群体具有丰富的遗传多样性，其单倍型数据可为该保护区绿海龟人工选育工作提供指导依据。

4 小结

本研究对3 个绿海龟地理群共132 个绿海龟的线粒体D-loop 基因部分序列进行了扩增、测序及分析，结果表明：3 个绿海龟地理群体的D-loop 基因片段序列的A+T 含量为68.2%，碱基组成具有明显的偏向性。132 个样本共定义了19 个单倍型，单倍型多样性在0.157～0.775 之间，核苷酸多样性在0.000 63～0.010 17 之间，本研究的绿海龟总体样本具有较高的遗传多样性。3 个群体间存在一定的分化，其中三沙群体和其他2 个群体存在高度的分化，粤西群体和海龟保护区圈养群体存在较小的分化，3 个群体之间存在基因交流现象。采用邻位连接法(NJ)对132 个序列片段和19 个单倍型分别构建了系统发育树，3 个群体的绿海龟存在较为复杂的交叉聚类现象，19 个单倍型聚类为3 个大的分支。