蛭蛇通络胶囊抗炎及舒张血管的有效组分辨识△

李煜，丁茹，张方博，杨洪军

1.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；

2.天津中医药大学，天津 301617；

3.陕西健民制药有限公司，陕西 咸阳 712000；

4.中国中医科学院 医学实验中心，北京 100700

脑卒中是导致全世界成年人死亡和致残的主要病因，由脑血管病变所致脑部血液供应障碍引起，导致脑组织缺血缺氧，出现神经功能损害，常伴有高血压、糖尿病和高脂血症等疾病[1]。其病理过程复杂，涉及炎症反应、能量代谢紊乱、血脑屏障损伤等[2]。通过治疗恢复脑血流后，也会导致一定程度的组织损伤[3]，因此探索有效治疗脑卒中的手段成为科学研究重点。

蛭蛇通络胶囊是由人参、黄芪、天麻、丹参、红花、葛根、川芎、石菖蒲、郁金、水蛭、冰片及乌梢蛇12 味中药组成，具有益气活血、息风通络等功效[4]，临床用于脑梗死恢复期患者，症见半身不遂、口舌歪斜、气短乏力等。缺血性脑卒中的病理机制可能涉及抗炎、抗氧化应激、血管舒缩等[5-6]。

含药肠吸收液主要应用于中药及中药复方质量评价、体外药理机制研究和有效成分辨识，具有避免未吸收成分的干预及耗时短等优点[7]。本研究从炎症及血管舒张的药理活性着手，利用脂多糖（LPS）刺激小鼠巨噬细胞株RAW264.7 致炎模型和大鼠离体胸主动脉舒缩模型，采用“肠吸收液-体外活性”结合拆方探索蛭蛇通络胶囊抗炎和舒张血管的作用机制，明确蛭蛇通络胶囊发挥抗炎及舒张血管作用的主要组分，并通过网络药理学探究其可行性和有效性。

1 材料

1.1 实验动物和细胞

无特定病原体（SPF）级雄性SD 大鼠10只，体质量180～220 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2014-0004，实验动物质量合格证号：11401300087638。实验前经中国中医科学院医学实验动物福利伦理委员会批准，伦理批准号为2021B093。实验期间大鼠饲养于中国中医科学院中药研究所动物房，室内温度为20～22 ℃，相对湿度为40%～70%，换气频率为15 次/h，确保自由饮食饮水。

小鼠巨噬细胞株RAW264.7 购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。采用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2 试药

人参、黄芪、天麻、丹参、葛根、水蛭、乌梢蛇、红花、川芎、郁金和石菖蒲药材均由陕西健民制药有限公司提供，所有药材均经该公司王建英执业药师按《中华人民共和国药典》2020 年版（一部）标准鉴定。泼尼松（批号：S173703，美国Selleckchem 公司）；DMEM 高糖培养基（批号：8119017，美国Gibco公司）；FBS（批号：A58G00J，美国Gemini 公司）；LPS（批号：818E034，北京索莱宝科技有限公司）；小鼠源白细胞介素-1α（IL-1α，批号：129030469）、IL-1β（批号：125030470）和IL-6（批号：J11030471）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司。

1.3 仪器

ALC-M 型组织-器官水浴系统、ALC-CWB 型数控恒温循环水槽均购于上海奥尔科特生物科技有公司；5452R 型低温超高速离心机（德国Eppendorf 公司）；SpectraMax M5 型多功能酶标仪（美国Becton-Dickinson 公司）；四通道离体组织器官灌流系统（美国Radnoti 公司）；MCO-18AIC 型CO2培养箱（日本Sanyo公司）。

1.4 网络药理学数据库

中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）；PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；BATMANTCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）；GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）；Venny 2.1.0 在线软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；STRING 数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）；Cytoscape 3.7.1 软件；Metascape数据库（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）。

2 方法

2.1 实验用溶液的制备

2.1.1台氏（Tyrode）缓冲液的配制 分别取KCl、NaH2PO4、NaCl、MgCl2、NaHCO3各0.28、0.05、8.0、0.1、1.0 g以双蒸水500 mL溶解，4 ℃保存备用；CaCl20.2 g 用双蒸水500 mL 溶解，4 ℃保存备用；使用前将两者混合，加入葡萄糖1.0 g，摇匀即得。

2.1.2各受试药物供试液的配制 根据蛭蛇通络胶囊的制备工艺路线，拆分为4 个组分，分别提取得到浸膏。浸膏1 为人参、黄芪、天麻、丹参和葛根用10 倍量60%乙醇提取2 次，合并提取液，滤过并减压浓缩即得；浸膏2 为水蛭、乌梢蛇和红花用10倍量水提取2 次，合并提取液，滤过并减压浓缩即得；浸膏3 为川芎、郁金和石菖蒲经水蒸气蒸馏提取4 h，滤过并减压浓缩即得；浸膏4 为合并以上3种浸膏，加60%乙醇适量，静置沉淀24 h，滤过并减压浓缩即得（不含冰片和挥发油）。分别称取浸膏1～4 各34.0 g，以Tyrode 缓冲液200 mL 溶解，制备各受试药物供试液。

2.1.3肠吸收液的制备 实验前大鼠禁食12 h，脱颈处死，沿腹中线剪开皮肤和肌肉，发现胃幽门，并在幽门下方10 cm 处截断肠段并冲洗干净。将硅胶套管的一端插入肠管中，肠道内表面翻转并用细线结扎。随后用0 ℃Tyrode缓冲液冲洗肠段内表面，另一端用线结扎牢固，以确保没有泄漏。含药肠吸收液（生药量均为170.0 mg·mL-1）需量取2.1.2项下各受试药物供试液25 mL，空白肠吸收液需量取Tyrode 缓冲液25 mL，预先将其加入麦氏浴管中，同时通入95% O2和5% CO2的混合气体，开启37 ℃恒温水浴循环系统。使用注射器吸取Tyrode 缓冲液2 mL，注入肠管中，然后将其置于麦氏浴管中。2 h后收集肠管内液体，0.22 μm 无菌滤膜滤过，即得组分1～3和全方4含药肠吸收液，-20 ℃保存待用。

2.1.4克-亨氏（Krebs-Hensleit，K-H）液的制备 取A 液溶质（NaCl 6.92 g、MgSO40.29 g、KH2PO40.16 g、NaHCO32.10 g、KCl 0.35 g）和B 液溶质（CaCl20.28 g），各加双蒸水溶解定容到500 mL，搅拌均匀，4 ℃保存备用，临用前将A 液500 mL 和B液500 mL混合，并加入葡萄糖2.0 g，摇匀即得。

2.2 LPS刺激RAW264.7细胞致炎模型

取对数生长期的RAW264.7 细胞，弃去原培养液，加入高糖DMEM 培养液适量，反复吹打后进行细胞计数，制成细胞密度为1×105个/mL 的单细胞悬液。在24孔细胞板上每孔接种细胞悬液1 mL，培养24 h，分为对照组、模型组、给药组和阳性药组，每组重复3 次。对照组加入空白肠吸收液，给药组加入2.1.3项下4个组分不同质量浓度肠吸收液，阳性药组加入不同质量浓度泼尼松，孵育24 h 后，加入1.5 µg·mL-1LPS 1 mL，作用48 h，收集各组上清液，ELISA 检测炎症因子IL-1α、IL-1β和IL-6 的表达。

2.3 离体血管舒缩活性

离体血管舒缩活性实验共分为6 组，即对照组（空白肠吸收液）、模型组（KCl刺激）和给药组（4个组分含药肠吸收液），实验共重复3 次。雄性SD 大鼠脱颈处死，剪开胸腔迅速取出胸主动脉条，放置于4 ℃K-H 液中，小心剥去附在胸主动脉上的脂肪及结缔组织，横切成长3～4 mm的血管环。将血管环悬挂于预置K-H 液5 mL 的浴槽中，温度（37.0±0.2）℃恒定，持续通入95% O2和5% CO2的混合气体。标本的一端固定，另一端经张力换能器连接Radnoti 离体组织灌流系统，记录实验过程中张力的变化。稳定过程先以0 g张力开始，维持10 min；调节其基础张力至1 g，平衡1 h，期间每隔20 min更换1次K-H液；主动脉环稳定后用1 mmol·L-1KCl 300µL刺激，作用15 min 后诱导血管环收缩，收缩稳定后用预热的K-H液洗脱；再次加入1 mmol·L-1KCl 300µL刺激，以激发最大收缩活性，收缩幅度为100%。4个组分的起始质量浓度均为5.0 mg·mL-1，采用累积加样法在浴槽中加入肠吸收液，累计依次加样至100、200、400、600、800、1600、2000µL，每10 min加入1 次。随着剂量的增加，舒张血管效应发挥时间越长，最后计量观察延长至30 min。以加入受试药物后的血管张力变化幅度与KCl 诱发最大收缩幅度之间的比率作血管舒张反应的量-效曲线，药物引起的收缩幅度均以第2 次KCl 引起的最大收缩幅度为相对标准值，用百分比表示。

2.4 网络药理学

TCMSP 数据库和BATMAN-TCM 数据库结合文献查找蛭蛇通络胶囊各药材成分信息[8-13]，通过成药性（DL）≥0.18，且口服生物利用度（OB）≥30%进行活性成分筛选。筛选活性成分后，利用PubChem 数据库查询其InChI 号，导入BATMANTCM 数据库进行靶点预测。在GeneCards 数据库分别以“inflammation”和“vasodilation”为关键词检索炎症和血管舒张靶点。蛭蛇通络胶囊和水蛭、乌梢蛇、红花组靶点分别与炎症和血管舒张靶点交集后得出韦恩图（Venny），并将交集靶点进行基因本体（GO）生物过程分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。STRING数据库构建交集靶点蛋白相互作用（PPI）网络，利用Cytoscape 3.7.1 进行拓扑分析，各靶点以Betweenness Centrality、Closeness Centrality 和Degree 均大于中位数筛选核心靶点，构建“药物-成分-靶点”网络。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 各组分及全方肠吸收液对LPS 刺激RAW264.7细胞产生炎症因子的影响

预实验已先用MTT 比色法筛选并确定各组分和全方对RAW264.7 细胞无毒性的质量浓度范围，应用于3 个组分及全方的所有质量浓度经验证均无细胞毒作用。抗炎实验结果表明，与对照组比较，模型组炎症因子IL-1α、IL-1β和IL-6 的水平显著升高（P＜0.05）。组分1只能抑制IL-6的表达，组分2、3，全方4 和泼尼松均能抑制IL-1α、IL-1β和IL-6 的表达。与组分3的抑制浓度相比，组分2的炎症抑制作用较好，但仍以全方4 的综合抑制作用最佳（表1～5）。

表1 不同质量浓度的组分1肠吸收液对LPS刺激RAW264.7细胞产生炎症因子的影响（, n=3）

表1 不同质量浓度的组分1肠吸收液对LPS刺激RAW264.7细胞产生炎症因子的影响（, n=3）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；表2～6同。

表2 不同质量浓度的组分2肠吸收液对LPS刺激RAW264.7细胞产生炎症因子的影响（, n=3）

表2 不同质量浓度的组分2肠吸收液对LPS刺激RAW264.7细胞产生炎症因子的影响（, n=3）

表3 不同质量浓度的组分3肠吸收液对LPS刺激RAW264.7细胞产生炎症因子的影响（, n=3）

表3 不同质量浓度的组分3肠吸收液对LPS刺激RAW264.7细胞产生炎症因子的影响（, n=3）

表4 不同质量浓度的全方4肠吸收液对LPS刺激RAW264.7细胞产生炎症因子的影响（, n=3）

表4 不同质量浓度的全方4肠吸收液对LPS刺激RAW264.7细胞产生炎症因子的影响（, n=3）

表5 不同质量浓度的泼尼松对LPS刺激RAW264.7细胞产生炎症因子的影响（, n=3）

表5 不同质量浓度的泼尼松对LPS刺激RAW264.7细胞产生炎症因子的影响（, n=3）

3.2 各组分及全方肠吸收液对离体血管舒张活性的影响

离体血管舒缩活性实验结果表明，组分1、2 和全方4 均有显著的舒张血管作用（P＜0.05），组分1和组分2在相同的质量浓度下，组分2的血管舒张率普遍更高，但仍以全方4 的舒张作用更强，舒张作用强弱顺序为全方4＞组分2＞组分1，而组分3 没有舒张血管作用（表6）。

表6 不同质量浓度的组分1、2及全方4肠吸收液对血管舒张活性的影响（, n=3）

表6 不同质量浓度的组分1、2及全方4肠吸收液对血管舒张活性的影响（, n=3）

炎症和血管舒张的实验研究结果表明，拆方后以组分2 的抗炎和舒张血管作用为最佳，但仍以全方4 的综合作用为最强。组分2 的组成中药为水蛭、乌梢蛇和红花，结合网络药理学阐释全方和组分2抗炎和舒张血管分子机制的异同。

3.3 网络药理学结果

3.3.1药物化学成分和靶点与炎症和血管舒张靶点预测 通过DL≥0.18 和OB≥30%筛选后，蛭蛇通络胶囊中符合条件的化学成分分布在人参26 个、黄芪23 个、天麻3 个、丹参69 个、红花27 个、葛根6个、川芎9 个、石菖蒲5 个、郁金15 个、水蛭3 个、冰片4 个、乌梢蛇3 个，共得到蛭蛇通络胶囊985 个潜在作用靶点，水蛭、乌梢蛇和红花组分390 个潜在作用靶点。炎症相关靶点10 498 个，血管舒张相关靶点499 个，蛭蛇通络胶囊与炎症、血管舒张交集靶点分别为778、181 个，水蛭、乌梢蛇和红花组分与炎症、血管舒张交集靶点分别为312、82个（图1）。

图1 蛭蛇通络胶囊与水蛭、乌梢蛇、红花组分抑制炎症和舒张血管靶点的韦恩图

3.3.2PPI 网络和“药物-化学成分-靶点”网络构建 利用STRING数据库构建PPI网络，蛭蛇通络胶囊抑制炎症靶点以Betweenness Centrality≥0.000 565 835，Closeness Centrality≥0.404 288 7 和Degree≥23 筛选获得核心靶点281 个，水蛭、乌梢蛇和红花抑制炎症靶点 以Betweenness Centrality≥0.001 561 12，Closeness Centrality≥0.395 532 875 和Degree≥12 筛选获得核心靶点102 个（图2）。蛭蛇通络胶囊舒张血管以Betweenness Centrality≥0.001 559 14，Closeness Centrality≥0.469 973 89 和Degree≥17 筛选获得核心靶点71 个，水蛭、乌梢蛇和红花舒张血管靶点 以Betweenness Centrality≥0.005 389 19，Closeness Centrality≥0.465 116 28 和Degree≥9 筛 选获得核心靶点31 个（图3）。蛭蛇通络胶囊与水蛭、乌梢蛇、红花组分抑制炎症共有88个相同核心靶点，舒张血管共有26 个相同核心靶点，并以核心靶点构建药物-化学成分-核心靶点相互作用网络图（图4～5）。

图2 蛭蛇通络胶囊与水蛭、乌梢蛇、红花组分抑制炎症核心靶点的PPI网络

图3 蛭蛇通络胶囊与水蛭、乌梢蛇、红花组分舒张血管核心靶点的PPI网络

图4 蛭蛇通络胶囊与水蛭、乌梢蛇、红花组分抑制炎症的药物-化学成分-靶点网络

图5 蛭蛇通络胶囊与水蛭、乌梢蛇、红花组分舒张血管的药物-化学成分-靶点网络

3.3.3富集分析 通过Metascape 数据库进行GO生物过程分析和KEGG 通路富集分析（P＜0.01）。蛭蛇通络胶囊和水蛭、乌梢蛇、红花组分抑制炎症的生物学过程共同涉及激素水平（regulation of hormone levels）和有机羟基化合物代谢过程（organic hydroxy compound metabolic process）等（图6），舒张血管共同涉及血液循环（blood circulation）和分泌调节（regulation of secretion）（图7）。蛭蛇通络胶囊和水蛭、乌梢蛇和红花组分抑制炎症KEGG 通路富集共同包括环磷酸腺苷（cAMP）信号通路和钙（calcium）信号通路等（图8），舒张血管共同与低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路和cAMP 信号通路等有关（图9）。

图6 蛭蛇通络胶囊与水蛭、乌梢蛇、红花组分抑制炎症的GO生物过程分析

图7 蛭蛇通络胶囊与水蛭、乌梢蛇、红花舒张血管的GO生物过程分析

图8 蛭蛇通络胶囊与水蛭、乌梢蛇、红花抑制炎症的KEGG信号通路富集分析

图9 蛭蛇通络胶囊与水蛭、乌梢蛇、红花舒张血管的KEGG信号通路富集分析

4 讨论

在我国，脑血管疾病是继癌症和心脏病之后的第三大导致死亡的原因[14]，死亡人数约占全球脑血管疾病死亡人数的1/3，而缺血性脑卒中属于较为常见的脑血管疾病，占脑卒中发生率和死亡率的首位[15]，有研究发现，随年龄增长农村地区居民的患病率高于城市居民，且不同年龄段男性患病率均高于女性[16]。西医治疗通常采用外科手术，常伴有再出血和神经损伤等风险。而大量研究表明，中药可通过调控体内炎症、氧化、凋亡、抑制血管痉挛和自噬等相关信号通路治疗脑卒中，并达到减少不良反应的目的[17]。炎症在脑卒中的发病机制中起着关键的作用，是治疗干预的一个重要指标[18]。急性炎症导致缺血性损伤，由血流停滞、血管中白细胞活化及缺血内皮和脑实质释放促炎介质引起的炎症反应，还可能增加组织损伤[19]。脑血管舒缩反应性（VMR）是指在给予强有力的血管舒张刺激前后脑血流（CBF）或脑血流速度（BFV）之间的变化，提供关于脑自动调节和脑血管储备能力的信息[20]。较低的脑血管舒缩反应性反映了血管系统普遍受损，预示死亡风险增加[21]。因此，脑血管舒缩反应性在脑卒中疾病治疗方面发挥着不可忽略的作用[22]，有效抑制炎症和舒张血管对脑卒中的治疗至关重要。

蛭蛇通络胶囊方中以人参和黄芪为君药，两者是中医药中著名的补气药，黄芪善补脾肺之气，益气养血[23]，人参补中益气[24]，其主要成分人参皂苷Rg1可通过抗炎和促增殖等机制调控血管生成，保护血管免受损伤。以丹参、红花、川芎、郁金、水蛭和乌梢蛇为臣药，丹参活血化瘀，广泛用于各种心脑血管疾病，可协同川芎扩张血管、增加脑血流量，在治疗缺血性脑卒中患者方面疗效确切[25]。红花活血通经、祛瘀止痛；郁金疏肝解郁、清心凉血、行气祛瘀，其化学成分莪术内酯已通过实验证实可抑制由LPS 诱发的炎症[26]，莪术二酮可以调节血管功能、抑制血小板凝集[27]。水蛭逐瘀破血，其成分可发挥凝血酶抑制剂的作用，从而预防和治疗血栓性疾病[28]。乌梢蛇祛风通络，助天麻、红花等活血化瘀，熄风镇痉[29]。天麻、葛根及石菖蒲为佐药，天麻熄风止痉；葛根生津退热；石菖蒲养心安神，诸药合用，共奏祛风通络之功效[30]。临床研究表明，蛭蛇通络胶囊治疗脑梗死恢复期较化学药效果更好，对于改善患者神经损伤程度具有明显作用[31]，但关于蛭蛇通络胶囊的作用机制及有效组分辨识尚未见报道。

本研究通过体外实验结合网络药理学的方法探究蛭蛇通络胶囊抗炎和舒张血管的主要有效组分。将具有12 味中药的大复方按照制备工艺路线的组分先进行拆解，再结合体外抗炎和舒张血管的实验，发现水蛭、乌梢蛇和红花组分抗炎和舒张血管效果最佳。水蛭的主要成分有直接作用于凝血系统的水蛭素等，蛋白酶抑制剂如水蛭透明质酸酶等，以及甾体类、蝶啶类、糖脂类和羧酸酯类等小分子化合物和微量元素[32]，具有抗炎、清除自由基、抑制内皮细胞损伤、增强梗死区血管新生、改善侧支循环和抑制血小板活化与聚集等作用[33]。乌梢蛇含有多种氨基酸、蛋白质（22.1%）、脂肪（1.7%）、核苷类成分和无机元素[34]，临床常采用水煎和酒浸方法入药，通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀和腹腔毛细血管通透性实验研究表明乌梢蛇水溶性和醇溶性部位均有较好的抗炎作用[35]。乌梢蛇常配伍出现于治疗脑卒中的中药复方中，但其单独或有效成分用于治疗脑卒中的实验研究尚未见报道。红花含有生物碱、黄酮、聚炔、亚精胺、甾醇、木脂素和多糖等多种化学成分[36]，其中红花黄色素和羟基红花黄色素A等主要成分具有改善血液循环、降血压、扩血管、抗凝、抑制血栓形成、镇痛和免疫抑制等作用[37]。羟基红花黄色素A通过调节以核转录因子-κB（NF-κB）为核心的信号通路，抑制炎症和氧化应激、调控血管平滑肌细胞的增殖和迁移、拮抗血小板活化、抑制神经细胞凋亡、保护血脑屏障等[38]。

蛭蛇通络胶囊全方和水蛭、乌梢蛇、红花组分抑制炎症筛选核心靶点时有胰岛素受体（INS）、肿瘤坏死因子（TNF）、SRC 原癌基因、非受体酪氨酸激酶（SRC）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）等88 个共同靶点，舒张血管筛选出核心靶点INS、TNF、IL-1β和PPARA 等26 个相同靶点。PPAR属于激素和脂质激活核受体家族，参与调节细胞分化、增殖和发育，在炎症及血管生成过程中发挥作用[39]。活化的PPAR通过拮抗脑损伤相关的氧化或炎症抑制神经元死亡，保护血管，抑制缺血后内皮功能的障碍，并诱导神经修复和内皮再生[40]。SRC 蛋白是SRC 家族的重要成员，也是目前研究最多的成员，广泛存在于组织细胞中，参与生长、代谢、发育和分化等过程，与肿瘤等疾病的发生和发展有着密切的联系[41]。微小核糖核酸（miR-137）通过靶向SRC 蛋白抑制炎症因子的分泌，并通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路减轻炎症反应、氧化应激、神经元损伤和认知障碍，最终抑制大脑中动脉栓塞小鼠星形胶质细胞凋亡[42]。蛭蛇通络胶囊全方和水蛭、乌梢蛇、红花组分均可能通过影响PPAR 和SRC 等靶点的活性影响炎症和血管活性，治疗脑卒中。

网络药理学结果显示，蛭蛇通络胶囊全方和水蛭、乌梢蛇、红花组分抑制炎症与舒张血管KEGG通路富集均包括cAMP 信号通路和钙信号通路等，舒张血管均与HIF-1信号通路和cAMP信号通路等有关。cAMP是重要的细胞内第二信使，可激活cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA），cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）是一种转录因子，在神经元兴奋性中起关键作用[43]。人参皂苷Rb1上调cAMP/PKA/CREB 通路的表达，刺激轴突再生和神经修复，改善大脑中动脉栓塞大鼠的神经功能[44]。白藜芦醇抑制磷酸二酯酶（PDE）的生成，并调节cAMP/AMPK/SIRT1通路，减少脑缺血期间的ATP 能量消耗，发挥神经保护作用[45]。HIF-1 是缺氧诱导炎症反应的一个重要的信号分子，作为磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、MAPK、细胞外调节蛋白激酶（ERK）和p38 激酶途径的底物[46]，有助于糖酵解和炎症基因的诱导，同时对巨噬细胞活化也至关重要[47]。小鼠敲除HIF-1α基因后，炎症增加，促炎因子表达水平升高，因此HIF-1α是控制炎症所必需的[48]。且通过PI3K/Akt/HIF 依赖性信号通路可上调内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达，从而改善内皮依赖性血管舒张[49]。HIF-1α通过NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎性体复合物调节炎症反应，影响脑缺血再灌注大鼠的神经细胞凋亡[50]。以上说明cAMP 信号通路和HIF-1 信号通路在脑卒中的发病机制中占据重要作用，蛭蛇通络胶囊全方和水蛭、乌梢蛇和红花组分均可能通过这2 条信号通路最终发挥治疗脑卒中的作用。

综上所述，蛭蛇通络胶囊可有效抑制炎症因子IL-1α、IL-1β和IL-6 的表达，促进离体血管舒张活性，表明其通过抗炎和舒张血管发挥治疗脑卒中的作用。拆方组分中，水蛭、乌梢蛇和红花是发挥抗炎和舒张血管作用的主要有效药味组合。虽然水蛭、乌梢蛇和红花组方可能无法反映全方拮抗炎症和舒张血管的全部活性，但根据制备工艺路线对中药大复方进行快速和简便拆解，辨识发挥关键药效的有效组分，有利于发现药效物质基础，控制中药复方的质量，并有利于阐释分子作用机制。