酱香风味传统发酵食品中微生物与风味形成的相关性

董玺梅，阮志强，蒋雪薇，2*

（1 长沙理工大学食品与生物工程学院 长沙 410114 2 湖南省调味品发酵工程技术研究中心 长沙 410600）

传统发酵食品历史悠久且种类丰富，其中大多数发酵食品已从传统作坊式发酵向工业化生产发展，如酱油、豆酱、食醋、白酒、米酒、泡菜、火腿等。传统发酵食品风味特征各异，包括酱香型、清香型、鲜香型等，这与发酵原料、工艺、微生物等多重因素有关。传统发酵食品多为复杂的微生物菌群混合发酵而成，其特殊风味的形成与微生物菌群利用原料进行复杂的代谢过程密切相关。发酵过程中，复杂的微生物通过各自的代谢作用改变发酵体系的环境而相互影响，微生物菌群结构的动态演替影响物质代谢，从而影响发酵食品的特征风味。合理的优势菌群结构及适宜风味形成的演替过程有利于发酵食品形成良好的风味，紊乱的菌群结构及腐败菌的污染易导致生物胺[1]、亚硝酸盐[2]等物质的产生，败坏发酵食品的风味，甚至带来食品质量安全问题。由此可见，阐明传统发酵食品中微生物多样性及其演替规律，发现其与风味形成的相关性，有利于复杂菌群发酵的传统食品安全及品质提升。

随着生物化学及分子生物学技术的发展，以及风味物质分析技术的不断更新，高通量测序技术、宏基因组学[3-4]、代谢组学技术[5]及风味物质的色谱-质谱联用分析技术[6]被广泛应用于传统发酵食品研究中。近年来，许多研究聚焦于传统发酵食品微生物多样性、菌群结构演替规律以及与风味的相关性[7-12]，为探明传统发酵食品的风味形成奠定基础。酱香风味是我国传统发酵食品中非常有特色的一类，主要代表是酱油、豆（瓣）酱、豆豉、酱香型白酒等，其风味物质除有传统发酵食品中的苯乙醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯等花果香、甜香风味化合物外，还包括愈创木酚、2，5-二甲基吡嗪、糠醛及HDMF 等典型的酱香风味物质。过去的研究认为酱香风味物质主要由美拉德反应产生，目前研究发现微生物的代谢作用对其形成也有重要影响。本文综述酱油、豆酱及酱香型白酒等酱香风味发酵食品的微生物多样性及其演替规律，以及对其特征风味形成的影响，为酱香风味发酵食品品质进一步提升提供理论依据。

1 酱香风味传统发酵食品中的微生物

传统发酵食品酿造微生物包括霉菌、酵母菌及细菌。其中，霉菌为主要发酵微生物，酵母菌及细菌中的大部分微生物为风味菌。这些微生物各具代谢功能，促进了发酵食品风味的形成及品质的提升。

酱油、豆酱、白酒等酱香风味传统发酵食品中主要的霉菌包括米曲霉、红曲霉、毛霉、根霉、青霉等（表1）。霉菌具有丰富的酶系，能有效分解淀粉及蛋白质原料，一方面，能为其它微生物的生长代谢提供物质基础；另一方面，分解蛋白质产生的氨基酸、多肽以及分解淀粉产生的麦芽糖、葡萄糖等代谢产物，可为发酵食品特征风味的形成奠定基础[29-30]。

表1 酱香风味传统发酵食品微生物及其作用Table 1 Microorganisms and their function in traditional fermentation foods with Jiang-flavor

酵母菌是传统发酵食品酿造过程中重要的微生物，其对发酵食品风味及品质具有重要影响。毕赤酵母、酿酒酵母、球拟酵母、汉逊酵母、假丝酵母等酵母菌在酱油、豆酱及酱香型白酒等酱香风味发酵食品中应用较为广泛（表1）。根据功能差异，可将其分为产醇酵母和产酯酵母两种类别。酿酒酵母是典型的产醇酵母，可分泌淀粉酶、酸性蛋白酶和β-葡萄糖苷酶，有利于后期的酒精发酵及高级醇的生成。球拟酵母属于产酯酵母，能提升发酵食品的香气，主要作用于发酵后期。球拟酵母能分泌酯酶，提升酯类风味，且能将木质素、阿魏酸等中间代谢产物转化成4-乙基苯酚和苯乙醇。此外，在发酵后期，部分酵母菌发生自溶，菌体内核酸类物质释放，有助于提升发酵食品的鲜味[22]。

传统发酵食品中细菌种类丰富，包括多种乳酸菌，如乳杆菌、魏斯氏菌、四联球菌，以及葡萄球菌和芽胞杆菌等，广泛存在于酱油、豆酱、豆瓣酱及酱香型白酒等酱香风味发酵食品中，其作用见表1。乳酸菌能产生乳酸、富马酸、琥珀酸等多种有机酸，为发酵食品增添香气和滋味的同时，还能为发酵体系提供酸性环境，在一定程度上抑制杂菌的污染。葡萄球菌具有较高的蛋白酶和淀粉酶活性，能高效水解蛋白质原料及淀粉质原料产生氨基酸、单糖及寡糖等，影响发酵食品的风味和色泽。芽胞杆菌能分泌多种胞外酶如蛋白酶、淀粉酶等，以及丙酮酸、酒石酸、维生素等代谢产物，此外，芽胞杆菌可以产生吡嗪类物质，赋予发酵食品酱香风味，其中四甲基吡嗪还具有保健功能[31-32]。

2 酱香风味传统发酵食品风味物质及其形成途径

微生物在发酵食品酿造过程中通过代谢活动降解原料中蛋白质、淀粉、脂质等大分子物质，生成氨基酸、小肽、单糖、寡糖、脂肪酸等，这些物质经进一步的代谢作用，可产生醇类、有机酸、醛类、酮类、酯类、含氮化合物、芳香族化合物等，构成传统发酵食品复杂的风味。

2.1 酱香风味传统发酵食品的感官评价

传统发酵食品的风味复杂，仪器及理化检测虽能对其中的各组分进行表征，但无法分析组分之间的协同作用及其产生的感官刺激，从而无法对发酵食品的风味做出综合评价。感官评价作为许多食品质量标准中的重要内容，是食品综合质量评价的常用方法[33]。传统发酵食品的感官评价主要包括色泽、香气、滋味、体态4 项评分指标。酱油、黄豆酱、酱香型白酒等酱香风味发酵食品的感官评价如表2所示。其中酱油、黄豆酱、威宁豆酱、豆豉酱的滋味感官评分权重最高，均为40 分，香气评分均为30 分，两者的总评分达70 分。从酱香型白酒的风味轮廓描述来看，其香气和滋味的权重也较高。酱香传统发酵食品风味的优劣在很程度上取决于滋味和香气。

表2 酱香风味传统发酵食品感官评价Table 2 Sensory evaluation of traditional fermentation foods with Jiang-flavor

2.2 酱香风味传统发酵食品特征风味的物质基础及其形成途径

传统发酵食品中的糖类、氨基酸、醇类、酯类、酸类、醛类、酚类、吡嗪类、呋喃（酮）类等化合物构成其风味形成的物质基础。这些物质的生成受发酵原料、工艺条件、微生物代谢和美拉德反应的综合影响。传统发酵食品的滋味和香气对整体风味的影响较大，下面阐述滋味和香气相关的风味物质及其形成途径。

传统发酵食品的滋味包括鲜味、甜味、苦味、酸味。鲜味和苦味主要源自鲜味氨基酸和苦味氨基酸，滋味相关的风味物质如表3所示。谷氨酸、天冬氨酸和肌苷酸贡献鲜味，缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸提供苦味[50]。这些氨基酸主要来源于微生物代谢过程中多肽经氨肽酶分解生成游离氨基酸和小肽，以及转氨酶、脱羧酶、脱氢酶和裂解酶等酶的协同作用下进行的一系列转氨、脱氨以及脱羧反应。甜味主要由淀粉原料分解成的葡萄糖、果糖、麦芽糖等组成。酸味主要由发酵过程中乳酸菌代谢及TCA 循环产生的各种有机酸组成，包括乳酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸等。

传统发酵食品中风味物质各具香气特征（表3），包括醇香、果香、花香、甜香、焦香、烘烤香、烟熏香，赋予发酵食品独特风味。醇类物质是发酵食品中醇香风味的主要来源，构成酱香型白酒的基础香气。醇类物质主要来源于米曲霉及酵母菌的代谢作用，包括糖酵解途径、Ehrlich 途径，以及醛类、酮类化合物的氧化反应。此外，醇类物质也是酯类化合物形成的物质基础。酯类化合物是发酵食品中果香、花香及甜香的主要贡献者，也是发酵食品中种类最丰富的一类物质。酯类物质主要由产酯酵母分泌的酯酶催化酸类物质和醇类物质反应生成。部分酯类物质通过醇解反应及非酶促反应生成。部分醇类、酸类、醛类物质也赋予发酵食品果香、花香及甜香。其中苯乙醇具有玫瑰花香，是酱油[42]和酱香型白酒[44]中的典型香气成分，主要来源于Ehrlich 途径。苯乙醛具有蜂蜜香气，对发酵食品整体香气具有调和作用，其主要产生途径包括氨基酸的降解及微生物转化。呋喃酮类、吡嗪类及酚类化合物是酱香风味发酵食品中典型的酱香物质。HDMF 和HEMF 赋予酱油、豆酱及酱香型白酒焦香，主要由鲁氏接合酵母代谢D-木酮糖-5-磷酸产生。吡嗪类物质具有烘烤香气，主要来源于美拉德反应及微生物代谢过程中氨基酸和糖类反应。吡嗪类物质的前体物质是2，3-丁二酮，有研究发现芽胞杆菌能产生2，3-丁二酮，认为芽胞杆菌是吡嗪类物质的主要贡献者[31，51]。4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-乙基苯酚赋予酱油、酱香型白酒烟熏风味，其形成途径包括发酵原料木质素降解，酵母菌分泌脱羧酶，还原酶促进阿魏酸、肉桂酸等有机酸的转化。

氢脱氢脱反化化脱径途成形其及质物味风的品食酵发统传味风香酱3表Flavor compounds and their forming pathway in traditional fermentation foods with Jiang-flavor Table 3 径途成形质物味风源来、脱酶羧、脱酶氨；转酸基氨离游为解分酶肽氨物生微经肽多酸苷、肌酸氨冬、天酸氨谷型香、酱酱瓣、豆豉、豆油及以氨、脱氨转的列系一行进下用作同协的酶等酶解裂和酶酒[40-41]应反羧上同酸氨、缬酸氨丙、苯酸氨、脯酸氨亮型香、酱酱瓣、豆豉、豆油酒、脱酶羧、脱酶氨；转酸基氨离游为解分酶肽氨物生微经肽多、糖萄、葡酸氨、赖酸氨、色酸氨、甘酸氨丙酒白型香、酱酱、豆油及以氨、脱氨转的列系一行进下用作同协的酶等酶解裂和酶糖、果糖芽麦[42]径途解酵[40-41]；糖应反羧[43]谢代菌酸、乳环TCA 循酸马、富酸檬、柠酸珀、琥酸、戊酸、乙酸乳酱瓣、豆酱、豆油[42]径途解酵糖醇丁、异醇二、2，3-丁醇、丙醇乙酒白型香、酱酱、豆油德拉美及化转物生、微解降酸基[43]；氨谢代菌酸、乳环TCA 循醛戊、异醛、壬酸辛酒白型香、酱油[43]应催酶化酯泌分母酵酯，产应反促酶非的质物类醇和质物类酸酸桂、月酯乙酸、丁酯戊异酸、乙酯乙酸乙酒白型香、酱酱、豆油[42]径途解酵，43]；糖[34应反解、醇应反化酯的醇二丁，3-、2酯乙酸、辛酯乙酸、癸酯乙[43-44]化转物生、微解降酸基[42]；氨径途Ehrlich酯乙苯酸、乙醛乙、苯醇甲、苯醇乙苯酒白型香、酱酱、豆油催酶化酯泌分母酵酯，产应反促酶非的质物类醇和质物类酸壬、γ-酯乙酸甲、苯酯乙酸乙、苯酯乙酸乳酒白型香、酱酱、豆油[43]谢代菌酸、乳环循，43-44]；TCA[34应反解、醇应反化酯的酸丁基甲、2-酸戊、异酯内[45-46]应反德拉、美谢代物生微醇、糠醛甲、苯醛HDMF、HEMF、糠型香、酱酱瓣、豆酱、豆油酒[47]应反类糖与酸基氨中程过谢代物生，微应反德拉美、嗪吡基甲三，5-，3、2嗪吡基甲四，6-，5，3 2酒白型香、酱酱、豆油吡基甲二，5-、2嗪吡基甲二，6--3基乙2-醇丁基甲、3-嗪的等酸桂、肉酸魏阿进促酶羧脱产菌母，酵解降素质木中料原创愈基乙、4-酚木创愈基烯乙、4-酚木创愈酒白型香、酱酱、豆油[48-49]应反羧酚苯基乙、4-酚木酱白酱白酱酱酱酱酱酱酱酱白酱酱征特味风味鲜味苦味甜味酸香醇香果香花香甜香焦香烤烘香熏烟素要价味滋气香评

传统发酵食品酿造过程中，复杂微生物通过多种代谢途径及生物转化生成一系列风味物质，这些风味化合物各具风味特征，其协同作用构成发酵食品的特殊风味。同时，也反映发酵过程中微生物菌群结构的动态演替与其风味形成密切相关。

3 酱香风味传统发酵食品中微生物多样性及其对风味形成的影响

3.1 微生物多样性

传统发酵食品是复杂微生物共同作用的结果，原料中丰富的营养物质以及开放或半开放的发酵环境，共同促成发酵食品中微生物的复杂性和多样性。

不同酱香风味发酵食品的微生物多样性存在差异。Mao 等[52]利用变性梯度凝胶电泳（Polymerase chain reaction -denatured gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE）技术研究甜面酱发酵过程中的微生物多样性，结果显示，芽胞杆菌、葡萄球菌及乳酸菌为优势细菌，米曲霉、鲁氏接合酵母、粉状毕赤酵母及康普茶接合酵母（Zygosaccharomyces kombuchaensis）为优势真菌。An 等[24]以豆酱为研究对象，通过高通量测序得出主要的细菌为四联球菌属、乳酸菌属、芽胞杆菌属及肠球菌属，主要优势真菌为曲霉属、毛霉属及根霉属。Liu等[19]用高通量测序技术解析郫县豆瓣酱发酵过程中的微生物多样性，结果显示，共检测到36 个属，包括27 个细菌属，9 个真菌属，其中明串珠菌属、乳酸菌属、魏斯氏菌属及葡萄球菌属为主要的细菌，真菌属以曲霉属、接合酵母属、毕赤酵母属居多。ITo 等[53]通过传统培养法揭示酱油中的主要微生物为嗜盐四联球菌、鲁氏接合酵母、埃切假丝酵母及皱状假丝酵母。相对传统培养法，用高通量测序鉴定到的微生物种类多。胡传旺[54]通过高通量测序华南地区高盐稀态酱油酿造过程中的微生物多样性，结果显示，所有样品中丰度≥0.01 的细菌属和真菌属的数量均为15 个，其中，魏斯氏菌属、葡萄球菌属、片球菌属、乳酸菌属、芽胞杆菌属为主要优势细菌，曲霉属、假丝酵母属、接合酵母属为主要优势真菌。与笔者研究的华中地区高盐稀态酱油酿造过程中微生物群落结构相比，两地区酿造酱油的优势微生物相同，而其丰度存在差异[55]；此外，华南地区的微生物组成较华中地区更为丰富[54]。这说明地区差异引起的环境变化是导致微生物群落结构不同的重要原因。酱香型白酒中的微生物多样性也是如此。Huang 等[56]采用高通量测序技术分析酱香型白酒酿造过程中细菌和真菌的平均OTU 数分别为389 和398，其中主要细菌属为醋酸菌属、乳杆菌属、魏斯氏菌属、明串珠菌属、芽胞杆菌属及高温放线菌属；毕赤酵母属、假丝酵母属、覆膜孢酵母属为优势真菌属；曲霉、青霉等常见霉菌较少，然而随着温度的升高，嗜热真菌属的丰度有所上升。沈毅等[57]通过高通量测序发现片球菌属和魏斯氏菌属为酱香型郎酒优势细菌，其次为芽胞杆菌属和乳杆菌属。

此外，不同类型的同种发酵食品的微生物菌群结构也存在差异，这可能与发酵工艺及酿造环境有关。Yang 等[25]通过高通量测序技术得出江西某公司豆豉发酵过程中细菌和真菌的平均OTU数分别为115 和22，其中葡萄球菌属和魏斯氏菌属为优势细菌，曲霉属和横梗霉属（Lichtheimia）为优势真菌。李薇等[58]以永州毛霉型豆豉为研究对象，通过高通量测序技术得出发酵过程中相对丰度>5%的细菌属和真菌属数量分别为25 个和17 个，主要细菌为芽胞杆菌属、代尔夫特菌属和根瘤菌属，真菌则以曲霉属、毛霉属、青霉属为主。随着分子生物学技术的发展，微生物多样性研究方法从传统微生物培养技术发展到PCR-DGGE技术，现已发展到高通量测序技术。高通量测序技术是目前的主流表征技术，实现了对环境中89%～99%不可培养微生物的检测。然而，基于二代测序方法的高通量测序技术只能鉴定到属水平的微生物，且分析结果存在无法分类的微生物。随着微生物多样性研究领域的不断扩大，更高水平、更精准的微生物多样性研究技术将得到发展。另外，微生物多样性与地区、原料、发酵工艺、酿造环境等因素密切相关。以华南地区高盐稀态酿造酱油为例，该地区气候湿润，环境中的微生物多样性丰富，导致该地区酱油酿造微生物较华中地区更为复杂。酱香型白酒采用开放式-半开放式发酵，环境中复杂的微生物导致酿造过程中微生物的多样性。不同地区酱香型白酒酿造微生物也存在差异，相对其它酱香风味发酵食品而言，酱香型白酒的微生物丰富度较大。此外，高温制曲是酱香型白酒风味形成的重要工序[59]，其发酵过程包括芽胞杆菌、高温放线菌等多种嗜热菌。酱油、豆瓣酱等含盐发酵食品的微生物多样性相对较低。豆瓣酱酿造体系的含盐量在8%左右，比高盐稀态酱油酿造体系的含盐量稍低，其微生物群落多样性更为丰富。

3.2 微生物群落演替规律及其对风味的影响

传统食品发酵是一个连续过程，微生物在这一过程发生有序演替。复杂的微生物通过代谢作用形成发酵食品丰富的物质构成，改变了发酵体系的环境，最终形成发酵食品的特征风味。

胡传旺[54]研究了酱油酿造过程中微生物演替及其对风味轮廓形成的影响，将酱油发酵过程分为乳酸发酵、乙醇发酵及后熟阶段3 个阶段。乳酸发酵阶段的微生物以米曲霉和乳酸菌为主，米曲霉通过酶的水解作用降解原料中的蛋白质及淀粉，乳酸菌进一步代谢米曲霉的水解产物产生大量有机酸；发酵体系中酸含量的增加改变了发酵体系的pH 值，从而影响微生物的生长及生物酶的活性，同时为后续微生物的代谢作用提供了底物。乙醇发酵阶段温度升高细菌量减少，鲁氏酵母迅速生长成为优势菌，利用还原糖大量积累醇类物质，间接促进了有机酸及酯类物质的产生。发酵后期，酱油发酵体系中微生物结构及其初级代谢产物含量达到动态平衡，耐盐生香酵母菌发挥作用，发酵前期积累的酸和醇发生反应生成酯类物质，这一过程既积累并提高了酱油香气，又降低了酱油中的酸类物质含量，赋予酱油合适的酸感。此外，部分微生物不适应高盐环境而发生自溶，释放出核苷酸、杂环化合物等物质，共同构成酱油的独特风味。

不同发酵食品微生物及其与风味相关性研究结果不尽相同。自然豆酱酿造过程中微生物群落演替相对简单，细菌中的四联球菌属及乳杆菌属为豆酱发酵绝对优势菌。发酵前期，细菌以四联球菌属为绝对优势菌，还包括少量海洋杆菌属、芽胞杆菌属及肠球杆菌属；真菌以毛霉菌属、根霉菌属和曲霉菌属等为主。发酵中期，乳杆菌的丰度迅速升高，与四联球菌属一起成为绝对优势菌，其它微生物的丰度大幅度降低，微生物群落结构趋于基本稳定。发酵末期，高耐盐的四联球菌和乳杆菌成为主要微生物，两者相互作用呈现此消彼长的状态。豆酱酿造微生物与风味物质相关性分析表明：发酵前期，霉菌利用其发达的酶系和较强的分解活性，降解原料中的大分子物质形成氨基酸、多糖等物质，酵母菌生成了醇类物质，高丰度的四联球菌通过糖酵解和糖异生途径产生大量乙酸和乙醇，为后期微生物的生长代谢提供物质基础；发酵中后期，肠球菌、乳杆菌、四联球菌与其它微生物的协同作用促进亚油酸乙酯、油酸乙酯等酯类香气物质的生成；此外，芽胞杆菌与Α-姜黄烯及6-戊基-2H-吡喃-2-酮呈正相关[60]。

高温制曲是酱香型白酒风味形成的重要工序[58]。酱香型白酒制曲过程中，大曲首先进入低温培霉阶段，该阶段霉菌大量生长，分泌了丰富的酶系。随着发酵的进行，品温逐渐升高，发酵进入高温阶段，此时，霉菌及酵母菌的生长受到抑制，芽胞杆菌等耐高温细菌逐渐增多。原料中的蛋白质经低温培霉阶段富集的蛋白酶降解成各种氨基酸，为吡嗪类物质的形成提供物质基础；同时，高温加快了微生物的代谢作用及美拉德反应，促进糠醛、呋喃酮类化合物等香气成分的产生及酱香风味的形成[61-62]。

综上可知，霉菌、酵母菌、细菌在各类酱香风味传统食品发酵过程中形成不同的菌群结构及演替规律，不同发酵阶段的优势菌对物质代谢有较大的影响，并进一步影响发酵食品的整体风味。合理调节发酵过程，形成有利于酱香风味物质积累的优势菌群，对发酵食品优良风味的形成具有重要的作用。

4 展望

酱香风味传统发酵食品风味特征独特，其酿造过程中的微生物组成繁多、微生物群落演替多样、代谢通路复杂。目前，对酱油、豆酱、酱香型白酒等发酵食品酿造过程中的微生物多样性及其与风味物质形成的相关性已开展一些研究，然而，微生物菌群的构成受哪些环境因素（如季节更替、气候变化、地域变化等）的影响尚未系统研究；另外，与风味物质形成相关的优势菌，关键风味物质的微生物积累机制还需深入研究。基于此，今后可关注以下几个研究方向：1） 运用更精确的微生物多样性表征技术（如第三代测序技术等）探明菌群信息；2）联合运用基因组学、蛋白质组学、转录组学、代谢组学等多组学技术，探明发酵过程中复杂菌群物质代谢的途径及代谢流的方向；3） 探明发酵食品菌群结构演替与风味物质形成的互作关系，实现对传统发酵食品酿造过程的智能化精准控制，以生产出更加质优味美的食品。