高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定深圳梧桐山野生蘑菇中5种鹅膏肽类毒素的含量

叶小莉,岳亚军,赖璟琦,朱 波,赖少阳,叶 敏,庄辉元

(深圳市罗湖区疾病预防控制中心,深圳 518020)

毒蘑菇也称毒蕈、毒菌等,我国的毒蘑菇种类丰富,已记载的有400多种[1],由毒蘑菇引起的中毒事件频频发生。在我国,约90%蘑菇中毒死亡是由含鹅膏肽类毒素的鹅膏菌引起的[2-3]。致毒的鹅膏肽类毒素主要有鹅膏毒肽和鬼笔毒肽。目前已分离出9种鹅膏毒肽,均为双环八肽结构,其中α-鹅膏毒肽(α-AMA)和β-鹅膏毒肽(β-AMA)在毒蘑菇中含量高、毒性大,是引起中毒的主要毒素,半数致死剂量分别为0.3,0.5 mg·kg-1[4-5]。鬼笔毒肽共有7种,均为双环七肽结构,其中羧基二羟鬼笔毒肽(PCD)、羧基三羟鬼笔毒肽(PSC)和二羟鬼笔毒肽(PHD)为主要毒性成分,半数致死剂量分别为1.5,4.5,2.0 mg·kg-1[4-5]。鹅膏肽类毒素化学性质稳定,耐高温、干燥和酸碱,易溶于甲醇、乙醇、液氨、吡啶和水,其毒性不能被常规烹饪方法破坏。

据文献[6]统计,2000-2019年间,华南地区共发生毒鹅膏中毒事件45起,其中深圳占8起。深圳梧桐山地处亚热带地区,有丰富的生物资源,野生蘑菇种类众多,近年来报道的因采摘野生蘑菇导致的食物中毒事件时有发生。致命鹅膏往往生长于黧蒴树下[3],而梧桐山上自然分布着两大片黧蒴林。2020年3月,发生了一起与梧桐山相关的致命鹅膏中毒事件,根据患者的描述,本项目组成员前往事发地先后采集包括致命鹅膏在内的共23种野生蘑菇,并带回实验室分析。

随着质谱技术的成熟与更新升级,近年来,鹅膏肽类毒素的检测方法主要有高效液相色谱-飞行时间质谱法[7-8]和高效液相色谱-串联质谱法[9-17]。基于三重四极杆质谱技术的检测方法具有灵敏度高、稳定性强、定性定量准确以及普及率广等优点。本工作以高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法同时测定野生蘑菇中α-AMA、β-AMA、PCD、PSC、PHD等5种鹅膏肽类毒素的含量,同时应用该方法对深圳梧桐山不同生长时期(生长期、成熟期和衰老期)致命鹅膏中的鹅膏肽类毒素含量进行测定,可为发生蘑菇中毒后毒源鉴定、卫生应急处置和中毒后能够准确诊断患者中毒程度以及抢救病人赢得时间,为该地区蘑菇中毒防控提供科学依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1200SL-6410B型RRLC-QQQ 高效液相色谱-质谱联用仪;Turbovap II型定量浓缩仪;3-30KS型台式冷冻离心机;T25型组织匀浆机;Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)。

PSC标准溶液:1 g·L-1,由湖南师范大学陈作红教授赠送。

单标准溶液:100 mg·L-1,分别取α-AMA、β-AMA、PCD 和PHD 标准品各1 mg,用乙腈超声溶解15 min,并分别定容至10 mL 容量瓶中,摇匀后置于-20 ℃冰箱中储存。

混合标准储备液:2 mg·L-1,分别取α-AMA、β-AMA、PCD 和PHD 单标准溶液100μL,PSC 标准溶液10μL,用水定容至5 mL容量瓶中。

混合标准溶液系列:取混合标准储备液10,25,50,100,250μL,分别用水定容至1mL容量瓶中,配制成质量浓度分别为20.0,50.0,100.0,200.0,500.0μg·L-1的混合标准溶液系列。

α-AMA 标准品的纯度大于95%;β-AMA 标准品的纯度大于98%;PCD 和PHD 标准品的纯度均大于90%;乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵均为色谱纯;乙酸、氨水为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),柱温40℃;流动相A为5mmol·L-1乙酸铵溶液,B为乙腈;流量0.3 mL·min-1;进样体积20.0μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源正离子(ESI+)模式;多反应监测(MRM)模式;干燥气温度350 ℃;干燥气流量11.0 L·min-1;雾化压力262kPa;毛细管电压4kV。其他质谱参数见表2,其中“*”为定量离子。

表2 5种鹅膏肽类毒素的质谱参数Tab.2 MS parameters of the 5 Amanita toxoids

1.3 试验方法

称取新鲜蘑菇1 g或干蘑菇0.2 g,置于50 mL离心管中,加10 mL 水,匀浆后超声10 min。以10 000 r·min-1转速离心5 min,分取1 mL 上清液过0.22μm 水相滤膜,滤液上机测定。如果蘑菇中鹅膏肽类毒素含量较高,超出线性范围,可减少称样量或者增大稀释倍数后再上机测定;如果蘑菇中鹅膏肽类毒素含量较低,可先对上清液进行净化、浓缩后再测定,即依次用2 mL 甲醇、2 mL 水活化Oasis HLB固相萃取柱,分取上清液5 mL过柱,用5%(体积分数)甲醇溶液1 mL 淋洗,抽干柱子后再用2 mL甲醇洗脱,收集洗脱液,于50 ℃氮吹至干,再用水溶解并稀释至1 mL,涡旋混匀后,用0.22μm 水相滤膜过滤,滤液上机测定。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

鹅膏肽类毒素的提取溶剂种类繁多,如含1%(体积分数,下同)乙酸的乙腈溶液、甲醇、体积比1∶1的含10%(体积分数,下同)甲酸的甲醇-水混合溶液、50%(体积分数,下同)甲醇溶液、水。试验对比了这5种提取溶剂的提取效果。结果显示:直接用含有机溶剂的提取溶剂提取蘑菇中低含量的毒素时,回收率低于70.0%,需要氮吹至干、用水复溶、过HLB固相萃取柱富集后再上机测定,由于新鲜蘑菇含水量大或含水提取溶剂用量较多,氮吹至干步骤耗时较长,10 mL 提取液耗费时间至少约30 min;水无毒且容易获取,提取液直接过HLB 固相萃取柱即可得到较高的回收率(＞80.0%)。从节约试验成本及时间等角度考虑,试验选择以水作提取溶剂。

2.2 流动相的选择

α-AMA 和β-AMA 的碳原子数均较多且母离子m/z很接近。当α-AMA 中1 个碳被13C 取代后,其母离子的m/z920.4(由自然界中13C 天然丰度1.10%计算得α-AMA 中13C 的丰度为43%,并由此计算m/z)和β-AMA 母离子的m/z920.3基本一致,二者具有相同的定性定量离子对。为了解决以上问题,使α-AMA 和β-AMA 实现基线分离,试验比较了分别以0.03%(体积分数,下同)氨水-乙腈体系、5 mmol·L-1乙酸铵-含0.1%(体积分数,下同)甲酸的甲醇体系和5 mmol·L-1乙酸铵-乙腈体系作流动相,以Agilent SB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)和ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)作固定相时5种鹅膏肽类毒素的色谱分离效果。

结果显示:以Agilent SB-C18色谱柱作固定相时,各毒素分离效果不佳,PCD 色谱峰出现拖尾现象;以ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱作固定相时,各毒素峰均能完全分开,且PCD 色谱峰无拖尾现象;以0.03%氨水-乙腈体系为流动相时,各毒素出峰较快,α-AMA、β-AMA 和PCD 色谱峰挨在一起,整体出峰效果不佳;以5 mmol·L-1乙酸铵-含0.1%甲酸的甲醇体系为流动相时,α-AMA 与β-AMA 色谱峰挨在一起,PCD、PHD 色谱峰出现重叠;以5 mmol·L-1乙酸铵-乙腈体系为流动相时,5种鹅膏肽类毒素的分离度均大于1.5,可实现完全分离,且峰形尖锐、对称。因此,试验选择ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱为固定相,5 mmol·L-1乙酸铵-乙腈体系为流动相。在优化的试验条件下,500.0μg·L-1混合标准溶液和样品溶液的总离子流色谱图见图1。

图1 5种鹅膏肽类毒素的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of the 5 Amanita toxoids

2.3 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以5种鹅膏肽类毒素的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,各毒素标准曲线的线性范围均为20.0～500.0μg·L-1,线性回归方程和相关系数见表3。

表3 线性参数Tab.3 Linearity parameters

分别以3 倍、10 倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),各毒素所得检出限均为6 ng·g-1,测定下限均为20 ng·g-1。

2.4 精密度和回收试验

按照试验方法对空白样品进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表4。

由表4 可知,5 种鹅膏肽类毒素的回收率为78.3%～98.3%,测定值的RSD 为0.30%～11%。

表4 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.5 样品分析

按照试验方法分析采集到的23种野生蘑菇,其中在1种当地俗称“白毒伞”的野生蘑菇中检出了α-AMA、β-AMA、PCD 和PSC,该蘑菇经中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所鉴定为致命鹅膏,而其他22种野生蘑菇中均未检出5种毒素,这与其他相关文献的研究结果[11,16,18,19]一致。

参考文献[18-20],将致命鹅膏子实体分为3个生长阶段:菌柄伸长、菌盖未打开、菌环与菌盖边缘相连的生长阶段为生长期;菌盖完全打开、菌环与菌盖边缘完全分离的生长阶段为成熟期;子实体开始枯萎、菌盖边缘上翘或开裂的生长阶段为衰老期。按照试验方法分析梧桐山不同生长阶段的致命鹅膏子实体,所得检测结果(均为湿重)见表5。

表5 致命鹅膏分析结果Tab.5 Analytical results of Amanita exitialis mg·g-1

由表5 可知:毒素总量在成熟期最高(1.50 mg·g-1),衰老期次之(1.19 mg·g-1),生长期最低(1.05 mg·g-1),不同生长阶段的毒素含量差异可能与降水量有关;3个生长阶段的子实体中β-AMA 含量均最高,成熟期、衰老期、生长期的检出量分别为0.57,0.48,0.37 mg·g-1,α-AMA 含量次之,成熟期、衰老期、生长期的检出量分别为0.39,0.31,0.28 mg·g-1,这与云南[16,18]和广州[19]的致命鹅膏以α-AMA 含量最高不同,推测可能与不同采集地土质和气候差异有关。

本工作以用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法同时测定深圳梧桐山野生蘑菇中5种鹅膏肽类毒素的含量。该方法操作简单、精密度高、准确度好,可为蘑菇中毒采集地追溯以及区域食品安全教育提供依据。