黔产玄参的“发汗”方法研究

邓 莹 刘 杰 魏学军 夏 朵 马江蚕

黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000

玄参为玄参科植物玄参ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根，具有清热凉血、滋阴降火、解毒散结的功能，临床常用于治疗热病热入营血、温毒发斑、热病伤阴、舌绛烦渴、津伤便秘、骨蒸劳嗽、目赤、咽痛、白喉、瘰疬与痈肿疮毒等症候，主产浙江、贵州、四川与河北等省区[1]。

发汗作为中药材产地加工的一种特殊方法，是影响中药材质量的重要因素之一，它可使药材变色、变软、增加香味或减少刺激性，其加工方法为将药材用微火烘或晒至半干或微蒸(煮)后堆置起来，使其内部发热而析出水分[2]。玄参的发汗方法在2020版《中华人民共和国药典》中规定为“冬季茎叶枯萎时采挖，除去根茎、幼芽、须根及泥沙，烘或晒至半干后堆放3～6 d，反复操作，直至干燥”[1]。但由于地域的差异性，目前在玄参的产地加工方法中，除了按照《中华人民共和国药典》规定的“发汗”方法加工之外，不同产地所采用的“发汗”方法各不相同[3]，已报道的文献中玄参“发汗”的质控指标仅局限于核苷类成分[4]，而玄参的主要化学成分有环烯醚萜类、苯丙素苷类、有机酸类等化学成分[5]，其中哈巴苷、哈巴俄苷具有抗炎作用[6-7]，肉桂酸具有泻下、抗细菌和真菌作用[8]，是玄参的主要生物活性成分。因此，本研究拟以哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸三种指标性成分的含量作为考察指标，比较“药典发汗”晒干品和烘干品、“蒸后发汗”晒干品和烘干品、“煮后发汗”晒干品和烘干品玄参中上述指标性成分含量，以综合评分法优选黔产玄参的“发汗”方法，以期为黔产玄参产地加工方法的建立提供实验性理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料 试验用新鲜玄参购于贵州省遵义市道真县玄参种植基地，经黔南民族医学高等专科学校中药教研室李香教授鉴定为玄参科植物玄参ScrophularianingpoensisHemsl.的根。哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸对照品均购自成都克洛玛生物科技有限公司(批号：CHB-H-006，CHB190105，CHB190106)，乙腈(色谱纯)，水为娃哈哈纯净水，余试剂均为分析纯。

1.2 仪器 高效液相色谱仪Agilent1260型(美国Agilent公司)；SG-4050C型数显恒温水浴锅(上海硕光公司)；AE240型电子分析天平(瑞士MettLer公司)；AS10200A 型超声波清洗机(杭州汇尔公司)；DHG-9240A型真空干燥箱(上海金山公司)。

2 方法与结果

2.1 样本的确定试验 药材经高效液相色谱法测定玄参中哈巴苷和哈巴俄苷的总量符合2020版《中国药典》规定(不少于0.45%)。

2.2 样品的制备

2.2.1 药典“发汗”晒干品(A1)[1]按《药典》记载方法操作。将新鲜玄参洗净后，晒至半干，于阴凉通风处堆放 3 d，取出，晒 1 d 后再堆放，反复发汗6次即可干燥。

2.2.2 药典“发汗”烘干品(A2)[1]按《药典》记载方法操作。将新鲜玄参洗净后，于 60 ℃ 烘至半干，于阴凉通风处堆放 3 d，取出，60 ℃ 烘 30 min 后再堆放，反复发汗3次即可干燥。

2.2.3 蒸后“发汗”晒干品(A3) 将新鲜玄参洗净后，于笼屉内隔水蒸 30 min(按“圆气”后计)后，取出，晒至半干，余步骤同“2.2.1”项。

2.2.4 蒸后“发汗”烘干品(A4) 将新鲜玄参洗净后，于笼屉内隔水蒸 30 min(按“圆气”后计)后，取出，于 60 ℃ 烘至半干，余步骤同“2.2.2”项。

2.2.5 煮后“发汗”晒干品(A5) 将新鲜玄参洗净后，于沸水中煮 30 min 后，捞出，晒至半干，余步骤同“2.2.1”项。

2.2.6 煮后“发汗”烘干品(A6) 将新鲜玄参洗净后，于沸水中煮 30 min 后，捞出，于 60 ℃ 烘至半干，余步骤同“2.2.2”项。

2.3 哈巴苷、哈巴俄苷的测定方法[1]

2.3.1 色谱条件 880975-902C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.03%磷酸水(B)，流动相梯度条件见表1。流速 1.0 mL/min；进样量 10 μL；柱温 20 ℃；检测波长 210 nm。对照品溶液、供试品溶液HPLC色谱图如图1所示。

表1 流动相梯度条件

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取A1～A6玄参样品粉末(过三号筛)各 0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇 50 mL，密塞称重，浸泡 1 h，超声提取(功率 500 W，频率 40 KHZ)45 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取哈巴苷对照品 6.05 mg、哈巴俄苷对照品 2.32 mg，置于 100 mL 量瓶中，加30%甲醇稀释成含哈巴苷 60.50 μg/mL、哈巴俄苷 23.20 μg/mL 的混合对照品溶液，冷藏备用。

2.4 肉桂酸的测定方法

2.4.1 色谱条件 880975-902C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.1%磷酸水(40∶60)；流速 1.0 mL/min；进样量 10 μL；柱温 25 ℃；检测波长 285 nm。对照品溶液、供试品溶液HPLC色谱图如图2所示。

2.4.2 供试品溶液的制备 精密称取A1～A6玄参样品粉末(过三号筛)各 1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入30%甲醇 20 mL，密塞称重，浸泡 1 h，超声提取(功率 500 W，频率 40 KHZ)30 min，提取3次，合并滤液定容至 100 mL，用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4.3 对照品溶液的制备 精密称取肉桂酸对照品 1.0 mg，置于 100 mL 量瓶中，加甲醇稀释成含肉桂酸 10 μg/mL 的对照品溶液，冷藏备用。

2.5 线性关系考察 精密吸取哈巴苷和哈巴俄苷混合对照品溶液、肉桂酸对照品溶液1、5、10、15、20、25 μL，按照“2.3.1”项下哈巴苷、哈巴俄苷和“2.4.1”项下肉桂酸色谱条件进样，以进样量(μg/mL)为横坐标X、峰面积Y为纵坐标进行回归。结果见表2。

表2 线性关系考察结果

2.6 方法学考察 精密吸取哈巴苷和哈巴俄苷混合对照品溶液、肉桂酸对照品溶液各 10 μL，按“2.3.1”项下哈巴苷、哈巴俄苷色谱条件和“2.4.1”项下肉桂酸色谱条件连续进样6次，结果哈巴苷峰面积RSD=0.76%，哈巴俄苷峰面积RSD=0.63%，肉桂酸峰面积RSD=1.3%，表明仪器精密度良好。取A1样品粉末(过三号筛)，6份，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备哈巴苷、哈巴俄苷供试品溶液，按“2.4.2”项下方法制备肉桂酸供试品溶液，分别依色谱条件测定并计算哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸含量，结果哈巴苷含量RSD=1.18%，哈巴俄苷含量RSD=1.78%，肉桂酸含量RSD=1.82%，表明该方法重复性良好。精密吸取哈巴苷和哈巴俄苷对照品溶液、肉桂酸对照品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 按相应色谱条件进行测定，结果哈巴苷含量RSD=1.14%，哈巴俄苷含量RSD=1.88%，肉桂酸含量RSD=0.81%，表明哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸对照品在 24 h 内保持稳定。取 0.25 g 哈巴苷含量为 0.53 mg、哈巴俄苷含量为 0.73 mg 的A1样品6份，精密称定，按表3精密加入适量哈巴苷、哈巴俄苷对照品，按“2.3.2”项下方法制备哈巴苷和哈巴俄苷供试品溶液，在“2.3.1”项下色谱条件测定并计算加样回收率；另取 0.5 g 肉桂酸含量为 0.46 mg 的A1样品，6份，精密称定，按表3精密加入适量肉桂酸对照品，按“2.4.2”项下方法制备肉桂酸供试品溶液，在“2.4.1”项下色谱条件下测定并计算加样回收率。试验结果见表3。

表3 加样回收率测定结果 (n=6)

2.8 样品含量测定 精密称取A1～A6玄参样品粉末(过三号筛)各 0.5 g，按“2.3.2”方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定并计算哈巴苷和哈巴俄苷含量，结果见表4。精密称取A1～A6玄参样品粉末(过三号筛)各 1.0 g，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件测定并计算肉桂酸含量。结果见表4。

表4结果显示，不同“发汗”加工方法对玄参中三种指标性成分的含量均有影响。从《药典》记载的定量指标哈巴苷和哈巴俄苷的总量来评价，各种“发汗”方法的制品均符合《药典》规定的含量要求。

表4 不同“发汗”加工方法哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸含量测定结果 (n=3)

2.9 综合评分法 优选玄参的“发汗”方法根据参考文献[9]，采用综合评分法优选玄参“发汗”方法。在数据处理时引用指标隶属度，即指标隶属度=(指标最大值-指标值) /(指标最大值-指标最小值) 。根据各指标在玄参中的重要性，考虑以哈巴苷占35%、哈巴俄苷占35%、肉桂酸占30%的权重，实验综合评分=哈巴苷占隶属度×35%+哈巴俄苷隶属度×35%+肉桂酸隶属度×30%，总分为1.00分。评分结果以综合分数作为总指标进行直观分析。结果见表5。

表5 综合评分

从表5的综合评分来看，得分最高的是A4样品，即蒸后发汗烘干品。因此，通过综合评分筛选出的玄参最佳发汗方法为：将新鲜玄参洗净后，于笼屉内隔水蒸 30 min(按“圆气”后计)后，取出，于 60 ℃ 烘至半干，于阴凉通风处堆放 3 d，取出，60 ℃ 烘 30 min 后再堆放，反复发汗3次。

3 讨论

药材在干燥过程中，含黏液质、淀粉或糖较多的药材不易干燥，经蒸、煮或烫处理后，则易干燥，而玄参气味有明显的焦糖气[2]，且已有文献资料[10]显示玄参中多糖含量达13.83%。因此，实验中样品制备方法的选择在2020版《中国药典》规定的玄参产地加工方法的基础上，参考文献[11-14]增加了“蒸后发汗”晒干品和烘干品、“煮后发汗”晒干品和烘干品。从发汗的时间来看，“蒸后发汗”和“煮后发汗”大大缩短了后续的晒或烘的时间。从哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸含量的综合评分来看，“蒸后发汗”品的综合评分明显高于“药典发汗”品和“煮后发汗”品，其中“蒸后发汗”烘干品的综合评分最高(0.9695)，但“煮后发汗”品综合评分相对较低，分析原因可能是新鲜玄参在煮的过程中与水接触导致哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸溶出。此外，每一种“发汗”烘干品的综合评分都高于晒干品，推测其原因可能是烘干品干燥的时间较短，减少了玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸三种有效成分的氧化或水解[15]。

黔产玄参的采收时间为10～11月，而此时贵州天气阴冷潮湿，平均温度为9～15 ℃，预实验在 15 ℃、20 ℃、25 ℃ 温度下考察“发汗”温度时，发现 20 ℃ 以上温度“发汗”都会使玄参发霉变质，因此本试验中所有样品“发汗”的温度均为 20 ℃ 以下的贵州常温，且样品干燥方法采用晒干法时，由于空气中水分含量较高，晒干的时间较长，增加了时间成本。因此，结合贵州的气候特点，建议黔产玄参“发汗”过程中干燥时采用烘干法，发汗样品的处理采用“蒸后发汗”法，该方法可为黔产玄参产地加工方法的建立提供参考。对于黔产玄参的发汗机制和药理作用还需进一步深入研究。