聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料水解酶结构、功能及改造

李志帅，高 健，陈纯琪，郭瑞庭，刘卫东,3，韩 旭

(1.中国科学院 天津工业生物技术研究所 工业酶国家工程实验室，天津 300308；2.中国科学院大学，北京 100049；3.国家合成生物技术创新中心，天津 300308；4.湖北大学 生命科学学院 省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室，湖北 武汉 430062)

聚酯类塑料聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)由对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)通过酯键连接而成。它是一种半结晶热塑性塑料，由均匀堆积的结晶区和随机排列的非晶区组成[1]。PET的合成技术在1941年首次被申请专利，并于20世纪50年代初开始商业化[2]，作为纺织工业的合成聚酯织物以及食品和饮料的包装材料，PET已成为最重要的大规模生产的石化塑料之一[3]，大多数PET制品有较高的结晶度，具有抵抗力学和化学应力的耐久性[4]。石油基塑料制品的大规模生产、大规模消费和废弃物管理不当所造成的气候变化和环境污染让人类社会面临前所未有的挑战[5-8]。近年来，利用生物技术进行塑料废弃物的回收利用已成为一个蓬勃发展的研究领域，许多研究人员对PET塑料降解酶进行结构解析、功能以及酶工程改造研究，获得了一些有潜在应用价值的高效降解酶[9-10]，并利用相关酶进行了催化反应研究尝试[11-13]，为将塑料废弃物进入低碳再循环利用铺平了道路。

1 PET塑料生物降解研究

早在20世纪70年代初，科学家开始研究塑料垃圾的生物降解[7,14-15]，人们曾认为熔点超过260 ℃的PET无法使用酶促解聚，但随着研究的深入，发现某些来自真菌的酶可以在高结晶度的PET材料上诱导表面改性[16]，如，来自丝状放线菌(Thermobifidafusca)的角质酶TfH(Thermobifidafuscahydrolase)，孵育3周后能让PET瓶(10%结晶度)的质量损失大于50%[17]。随着近几年对降解酶的进一步研究，TfH水解PET的活性已经被提高了一个数量级以上[18]。利用宏基因组方法鉴定出来的叶枝堆肥角质酶LCC[19]也是近期研究的热点，目前获得的最好突变体可在10 h内以工业规模快速解聚非晶化PET废物，回收的单体可用于合成相关聚合物，从而将废弃物进入低碳再循环利用。近期，受关注较多的是PET降解菌Ideonellasakaiensis201-F6[20]，它能以PET为主要能量和唯一碳源，在30 ℃能将PET分解成小片段——单(2-羟乙基)对苯二甲酸(MHET)，再将分解后的产物运入体内进一步经过IsMHETase(MHET降解酶)水解，最终转化为TPA和EG，它们的催化反应见图1。IsPETase和其他具有PET降解活性的酯酶或脂肪酶序列同源性较高，但它在30 ℃下水解PET的活性比其他酯酶或脂肪酶高5.5～120倍[21]。目前已知的催化PET水解酶大多属于α/β-水解酶家族[22]，α/β-水解酶根据形成氧阴离子孔的氨基酸不同，可以分为GX型和GGGX型以及Y型[23]，现有的IsPETase等PET降解酶都属于GX型[24]。

图1 Ideonella sakaiensis 201-F6 中关键PET降解酶的反应

2 PET塑料降解酶的结构

由于酯键在天然生物分子(如角质和亚角质)中普遍存在，所以角质酶是寻找能解聚合成聚酯酶的起点，目前获得的能降解PET塑料的酶也主要来源于能水解酯键的脂肪酶、角质酶以及水解酶三大类，已有超过60个PET塑料降解酶的晶体结构被发现，详见表1。

表1 现有PET塑料降解酶结构

将这些不同来源的PET塑料降解酶的序列通过MEGA 11.0软件构建系统发育树，结果见图2(a)，大部分PET塑料降解酶同源性较为接近。图2(b)展示了不同来源的PET塑料降解酶单体结构重叠比对，可以发现它们的整体结构折叠基本相同。将这些PET塑料降解酶和来自Streptemycesefoliatus的脂肪酶(PDB：1JFR)进行主链均方根(RMSD[55])比较，可以发现所有比值均低于0.07 nm(表2)，表明它们的主链结构一致性很高。这些PET水解酶表现出保守的结构特性，并且可以分类为单个亚类，第一个获得晶体结构的是链霉菌来源的脂肪酶(PDB：1JFR)，该酶比聚酯水解真菌角质酶(EC 3.1.1.74)有更短的肽链和更紧凑的结构[56]。

表2 不同PET降解酶主链结构比对

1JFR—灰色；7EC8—黄橙色；3VIS—绿色；4CG2—青色；6THT—洋红；4WFI—黄色；5LUI—橙色；7DS7—深蓝色；5XH3—浅色；6SBN—热粉色；7DZT—紫罗兰紫色；7NEI—蓝白色

3 PET塑料降解酶的催化机制

自从2017年首个IsPETase的晶体结构报道以来[39]，有许多不同研究组都报道了IsPETase的晶体结构[40-51]，对IsPETase结构研究也是PET水解酶里面研究得最多的[57]。IsPETase由261个氨基酸组成(图3(a))，属于典型的α/β-水解酶折叠类结构域，结构中有9个β-折叠，外围有7个α-螺旋，具有保守的催化三联体S131-H208-D177和氧阴离子洞穴(Y58、M132)，S131作为亲核试剂和H208、D177形成电荷中继网络(图3(b))，PET塑料降解酶可能的催化机制见图3(c)。

IsPETase具有不同于其他PET水解酶的独特结构。它有2个分子内二硫键：DS1(C174-C210)和DS2(C244-C260)。序列比对后发现，DS2是这类水解酶共有的，它连接C末端和最后一段loop区，远离催化活性中心，所以DS2不直接参与水解，主要与酶结构的完整性相关。DS1是IsPETase特有的二硫键结构，临近催化中心，对催化活性和催化位点的完整性至关重要，分子动力学模拟证明DS1与活性位点的柔韧性相关，将其突变后会使催化三联体不稳定，从而导致酶活性几乎完全丧失[41](图3(a))。IsPETase底物结合区的1个氨基酸W156侧链具有A、B和C这3种构型(图3(b))，底物结合之后，W156侧链被固定为B构型，并为底物的结合提供重要的作用力，W156位点的色氨酸在所有类似酶中是保守的，在其他类似酶中W156侧链一般为C构型，但这种C构型并不利于底物PET结合，所以其他类似酶对PET的降解活力较低。进一步分析发现，IsPETase中的W156侧链能够摆动是因为其邻近的第185位丝氨酸(S185)，而在其他活力较低的类似酶中都是组氨酸，组氨酸与W156之间的堆叠作用力将W156的侧链固定在了C构型，所以将IsPETase的S185突变成为组氨酸后，酶对PET的水解效率显著降低[39]。IsPETase特有的结构可以维持它对PET较高活性和结构稳定性，一旦将催化三联体中的丝氨酸突变成丙氨酸后，活性完全丧失[40,42,58]；如果破坏其二硫键DS1会导致活性降低，Tm值下降10 ℃，表明IsPETase特有的二硫键结构对活性和稳定性都至关重要。若将氧阴离子洞穴中的氨基酸Y58突变后再结合不同底物(PET膜、PET瓶子和BHET单体)发现，酶活性降低[47]；氧阴离子洞穴的另一个氨基酸M132突变成其他氨基酸后同样会引起酶活性的降低；摆动的W156替换成丙氨酸后也会引起活性的显著降低[42,45]。

图3 IsPETase的晶体结构及催化机制

4 PET塑料降解酶的分子改造

一般认为，PET水解酶的催化中心在与芳香族底物结合后会发生局部动态变化，所以在获得酶的结构后，许多研究工作都集中在活性区域。IsPETase中摆动的W156，在许多其他已知的PET水解酶中也是保守的，该残基的取代通常导致对PET的水解活性显著降低，Chen等[50]发现S185和I189独特地存在于IsPETase中，可以减少W156的空间位阻(图4)，因此使吲哚侧链具有更高的柔韧性，以提高聚合物的水解速率。在同源的聚酯水解酶中引入相应的双残基取代可提高PET水解活性。底物结合区附近的氨基酸也会影响酶活性，将IsPETase的I179、W130和T59分别突变为丙氨酸后发现，酶活性显著降低，说明这些氨基酸对催化很重要[39-40]。他们对底物结合位点Ⅱ区的氨基酸也进行了突变(图4)后发现，S209A和N212A突变的酶活性显著降低。Son等[44]研究发现，P152A突变导致酶在30和40 ℃下活性降低，但Tm比野生型IsPETase的高0.5 ℃，解析IsPETaseP152A的结构(PDB：6IJ5)发现催化位点D177从H208残基转移开，证实突变导致催化位点塌陷[44]。将IsPETase结合位点变为更像角质酶的活性位点(S209F/W130H)，突变体的活性提高了1～2倍，F209可能是通过芳香族相互作用来稳定底物和活性部位[42]。

由于PET降解酶降解的是高聚长链化合物，所以PET降解酶中离活性中心略远的氨基酸残基也可能影响催化作用，或与蛋白表面其他的氨基酸残基有相互作用，但这需要通过了解长链PET特定的结合构象才能确定。靠近目标酯键的长链聚合物需要足够的空间，才能通过催化位点丝氨酸的初始亲核攻击形成四面体的催化中间体[59]。迄今为止，并没有长链底物的复合物结构被解析，仅仅有很少的PET水解酶和产物单体类似物复合体结构被研究，所以Joo等[40]利用分子对接以及分子动力学模拟等方法来研究结合口袋中底物和催化三联体的作用。他们通过对较长底物2-HE(MHET)与IsPETase的对接实验，推测了长链底物在酶表面可能的结合位置，较长的分子在酶表面通过疏水作用形成一个约4 nm的长且浅的L形裂缝，结合位点分为2个亚位点，亚位点I结合1个MHET，结合位点Ⅱ结合3个MHET。结构分析发现，距离催化中心约2.3 nm的R251在底物结合位点Ⅱ区(图4)，呈现突出状，影响底物PET的结合。如果将R251突变成丙氨酸后，突变酶18和36 h对PET膜的活性比野生型对PET膜的活性分别提高了22.4%和32.4%；由所得到的蛋白结构(PDB：5YNS)发现丙氨酸提供了一个疏水且不突出的裂缝，由此可见，远离活性部位的关键结构变化可能会影响酶的活性[24,44]。IsPETase比同源的角质酶和酯酶具有更开放的活性位点裂缝，通过改造还可以降解另一种新兴的生物衍生PET替代品，聚乙烯-2,5-呋喃二甲酸酯(PEF)[58]。IsPETase突变体S64M、W130F和N212F可以提高萘酯降解性能，对它们的结构分析发现，这些突变改变了疏水性，降低了酶特异性的空间效应[43]。已报道的基于IsPETase结构的关键改造位点如图4所示，大部分改造都集中于底物结合的Ⅰ区和Ⅱ区，许多有益突变位于带正电荷的Ⅱ区[27]，说明Ⅱ区与底物的结合有关。

图4 IsPETase中已知的关键改造位点

PET材料自身较高的玻璃化转变温度要求水解酶具有较高的热稳定性[43]，因此在解聚中使用嗜热且热稳定性良好的酶有明显的优势[10]。野生型IsPETase的熔融温度(Tm)为48.81 ℃[47]，但其在环境温度下具有较高的PET水解活性，这可能是由于其更灵活和开放的底物结合裂缝所致[58]。所以许多研究者通过酶工程对IsPETase进行改造来提高其热稳定性[43]，在二价离子(如Ca2+或Mg2+)存在下，许多细菌来源的PET水解酶的整体热稳定性得到改善，Tm增加10～16 ℃，或最适温度提高10 ℃。基于共结晶结构和分子动力学模拟，Baker等[60]发现Ca2+结合位点可能接近催化三联体，并且通过与Ca2+的相互作用来控制底物结合过程，活性位点会存在打开和关闭的状态，由于反应过程中Ca2+会和苯二甲酸酯产生不溶性副产物[60]，所以不能完全依赖钙盐来实现工业级高降解效率，但可通过定制生物催化剂使Ca2+结合位点最小化，如通过盐桥或二硫键取代一个主要的Ca2+结合位点，如来自Thermobifidafusca的TfCut2，按此方法获得的突变体Tm提高了25 ℃，并通过蛋白质晶体学验证了二硫键的形成[61-62]。在另外一个PET塑料降解酶PET2中，也用同样策略引入并确证了二硫键的存在，但Tm仅仅提高了3.1 ℃[27]。通过与热稳定性较高的TfCut2等酶结构的比较发现，改造获得IsPETaseS92D/D157H双突变体的Tm比野生型提高了8 ℃[47]，这些氨基酸可能形成额外的氢键来提高β6～β7连接环的稳定性，在40 ℃下，24和72 h的催化活性分别提高4.7和6.0倍。研究者将这些发现相结合，设计了2个三重突变体S92D/D157H/R251A和S92E/D157H/R251A，2个突变体的Tm值分别为56.41和57.62 ℃，比野生型IsPETase的提高了7.60和8.81 ℃，2个突变体的活性也比野生型的有所提高，在30 ℃下24和72 h的酶活性分别提高了4.3和5.2倍，在40 ℃下24和72 h的酶活性分别增加了9.1和13.9倍。但四突变体S92E/D157H/N217D/251A的酶活性和热稳定性都降低。另一个四突变体S92E/D157H/S213T/N217D(PDB：6KUS)的酶活性和Tm都高于IsPETase的，37 ℃下酶活性是野生型的58倍[47]。基于IsPETase结构改造获得的突变体ThermoPETase(92E/D157H/R251A)，40 ℃下活性也提高了14倍，Tm比野生型的提高8.8 ℃[44]。

除了上述基于酶结构的改造外，近期比较受关注的其他技术，如人工智能和机器学习等技术，也被用于PET塑料降解酶的改造。基于贪婪积累策略方法获得的DuraPETase是具有10个氨基酸突变的IsPETase突变体(A185H/I139R/W130H/S159Q/R251A/A151I/G136A/Q80Y/L88F/T111D)，比野生型IsPETase的Tm大幅度增加(达31 ℃)，对高结晶度PET粉末水解活性也超过了300倍[48]。通过基于机器学习并应用卷积神经网络训练稳定性优化，获得DuraPETase+N204K突变体，Tm进一步提高至83.5 ℃，是目前Tm最高的IsPETase突变体[63]。

定向进化也被用于塑料降解酶性能的提升，通过筛选基于易错PCR的随机IsPETase文库，对超过13 000个IsPETase的突变体进行评估，将高温下的催化活性作为主要选择指标，与野生型IsPETase相比，获得了21个突变的HotPETase变体(ThermoPETase+N204C/S253C/P152V/S178R/S185Y/Q90K/S184E/R61T/Q153M/N183K/R195L/S29A/S32V/K66N/M125G/N212C/K223M/T241Q)，Tm则提高至82.5 ℃[64]。基于Meng等[65]开发的自然序列进化的突变设计工具Premuse，筛选到了稳定性较高的IsPETase突变体W130H/F200Y，双突变体在40 ℃下24 h降解无定形PET膜片的效率比野生型的提高了近40倍。

不同表达系统表达出的酶，因为后续翻译修饰系统不同，对酶的性能也可能会产生影响，当PET水解酶在除大肠杆菌以外的宿主(例如枯草芽孢杆菌或巴斯德毕赤酵母)中表达时，热稳定性也有可能增强，如LCC分别在枯草芽孢杆菌和巴斯德毕赤酵母中表达，糖基化程度增加，Tm比在大肠杆菌中表达分别增加了4和12 ℃[66]。在毕赤酵母中表达的IsPETase活性可以提高36倍[67]。除了Pseudomonasputida、Escherichiacoli和Pichiapastoris等底盘之外，Ideonellasakaiensis也成为新兴的可用作基因工程底盘的菌株[68]。光合微藻(Phaeodactylumtricornutum)也被设计用于功能性表达IsPETase，并能够在21～30 ℃的咸水环境中降解选定的PET相关材料，是受PET微塑料污染海水的潜在生物修复载体[69]。总结已报道的IsPETase的性能见表3。

表3 IsPETase突变体性能比较

5 PET塑料降解酶的催化过程强化

与天然聚合物降解酶(如纤维素酶)类似，酶促聚酯水解优先发生在无定形部分，而不是良好有序的结晶区域[70]，特定的酶可以降低聚合物的结晶度，如在天然纤维素酶系统中发现的使纤维素去结晶的酶[71]，特异性的聚合物结合模块添加到反应混合物中或与适当的降解酶融合，均有机会提升降解酶的活性。来自Cellulomonasfimi的纤维素结合结构域(CenA)和来自里氏木霉的纤维二糖水解酶I的纤维素结合结构域(CBM)[72]、来自粪产碱杆菌的PHA解聚酶的聚羟基链烷酸酯(PHA)结合模块[73]、来自ChitinolyticbactermeiyuanensisSYBCH194的几丁质酶CmChi1的几丁质结合模块和PET降解酶融合表达都能提高降解性能[74-75]。将来自白腐真菌Pycnoporuscoccineus(PcAA14A)的裂解多糖单加氧酶(LPMO)[76]和两性离子聚合物(Ekylation，带正电荷的赖氨酸和带负电荷的谷氨酸)[77]加入IsPETase中，都可以提高酶对PET的降解性能，它们可能是通过与疏水蛋白或其他结合模块不同的机制促进酶促降解。生物催化水解不能从根本上破坏有序的结晶PET[70]，但氧化酶可能具有与木质素、纤维素降解系统中已知的LPMO相同的功能，可以为聚酯去结晶度的开发提供进一步的选择，具有酶促纺织品回收方面的应用潜力。

强化PET塑料降解酶的催化过程，还可以从解除反应底物抑制方面着手。对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯(MHET)和对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)是PET降解的中间体，会抑制许多PET水解酶解聚催化的效率[78-81]。MHET具有强抑制作用，几乎不能被野生型IsPETase水解酶水解，而Ideonellasakaiensis产生独特的IsMHETase水解MHET，产生TPA和EG[20]，这2种不同酶类(IsPETase和IsMHETase)可以串联起来进行聚合物降解，有助于它们在PET废弃物有效生物循环中的应用。Knott等[82]建立了一种嵌合双酶系统，将IsPETase和IsMHETase连接，使得PET降解效率提高至少2.8倍；并鉴定了来自Comamonasthiooxydans和Hydrogenophagasp.PML113116的具有MHETase酶类似的结构[82]，但它们对MHET的底物亲和力显著低于IsMHETase。目前对这些技术瓶颈，提出了其他技术解决方案，例如使用不易受产物抑制的酶突变体[83]或用能渗透去除抑制剂的膜反应器。这种催化特性可以和其他解聚酶的特性进行组合，用于基于全细胞的多种酶系统[84]，以达到PET生物降解的目的。

6 结论与展望

在过去二十年中，PET的生物催化降解已从数周培养后有微量释放的单体发展到数小时内完成高效的塑料解聚，科学家们已经成功地鉴定和制造了符合工业和商业规模的PET废弃物解聚需求的生物催化剂[85]。未来可以利用生物催化剂降解塑料PET生成单体TPA和EG，然后利用产物TPA重新合成PET塑料，实现PET塑料的绿色循环利用。但如何高效回收TPA单体，将其循环利用生成高价值的PET再生塑料，仍是PET生物降解回收的瓶颈问题。由于大规模测序数据的持续增长，可从基因组和宏基因组数据库中探索其他新型PET水解酶[86]，更多的PET水解酶序列数据被挖掘。通过机器学习和祖先序列重建，探索的序列空间也可用于预测具有改进特性的酶。强大的基于序列的方法和全自动计算工作流程设计软件如FireProtASR等[87]，可以帮助研究人员通过数据库搜索确定更多的PET水解酶。未来的研究主要在于拓展对PET生物降解的理解，以应对与其他塑料(如聚烯烃)或更类似的塑料(如聚酰胺(PA)和聚氨酯(PUR))与可水解骨架的生物技术降解相关的挑战。这些废弃物不能通过工业规模的其他处理方法有效回收，而新型生物催化剂的组合可以为未分类的混合塑料废弃物的可循环利用铺平道路。