青藤碱基于CASC11/AKT3轴对脑胶质瘤原位荷瘤裸鼠肿瘤生长及血管生成的抑制作用▲

祁大勇 刘 军 赵志煌 李 刚 韩永刚

(1 河北省唐山市工人医院神经外科，河北省唐山市 063000； 2 河北省邯郸市第一医院神经外科，河北省邯郸市 056000； 3 河北省沧州市中心医院神经外科，河北省沧州市 061000)

脑胶质瘤是临床常见的颅内原发性肿瘤，其在颅内恶性肿瘤中的占比超过80%，年发病率约为0.06‰，且随年龄的增长发病率逐渐升高，具有恶性程度高、易复发、预后差等特征[1]。近年来，随着手术切除方案及放化疗方案的不断优化，脑胶质瘤患者的预后有所改善；但血脑屏障会限制化疗药物的效果，加之脑胶质瘤的侵袭性高，患者的临床治疗效果受到明显影响，其中高度恶性脑胶质瘤患者的中位生存期仍不到15个月[2]。青藤碱是中药青风藤的主要有效成分，具有镇痛、降压、增强胃肠道兴奋性、抗炎等药理作用[3]。有研究表明，青藤碱可抑制视网膜母细胞瘤细胞的增殖，并促进肿瘤细胞的凋亡，具有抗肿瘤活性[4]。然而，目前关于将青藤碱用于脑胶质瘤治疗的研究尚少，且缺乏对应的机制研究。本研究通过建立脑胶质瘤原位荷瘤小鼠模型，研究青藤碱对脑胶质瘤血管生成的抑制作用，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞株 无特定病原体级BALB/c裸鼠45只，雄性，6周龄，体重(19±2)g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司[生产许可SCXK(沪)2017-0010]。大鼠购入后饲养于清洁、通风环境，温度为(23±2) ℃，湿度为(60±5)%，明暗周期12 h/12 h循环。人脑星形胶质母细胞瘤U87-MG细胞株购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物、主要试剂、仪器 青藤碱(纯度>98%)购自上海禾午生物科技有限公司(批号：6080-33-7)。LipofectamineTM3000试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司(批号：L3000001)，肿瘤易感候选基因11(cancer susceptibility candidate 11,CASC11) mimics质粒购自上海锐赛生物技术有限公司，TRIzol试剂购自上海联迈生物工程有限公司(批号：LM-0010)，反转录试剂盒购自苏州宇恒生物科技有限公司(批号：R2043)，实时荧光定量PCR SYBR Ⅱ试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司(批号：QPG-020)，免疫组织化学染色试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司(批号：E670033-0100)，二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒购自上海睿时生物科技有限公司(批号：23225)，辣根过氧化物酶标记的二抗购自武汉艾美捷科技有限公司(批号：A21010)， GAPDH、兔抗小鼠CD31、丝氨酸/苏氨酸激酶3(serine/threonine kinase 3，AKT3)一抗购自美国Abcam公司(批号：Ab9485、ab28364、ab32505)。StepOnePulsTM实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，BX41显微镜购自日本奥林巴斯株式会社，Gel Doc EZ凝胶成像分析系统购自美国伯乐公司。

1.3 细胞培养及转染 将人脑星形胶质母细胞瘤U87-MG细胞置于含有10%胎牛血清+1%青链霉素双抗的DMEM中，37 ℃、 5% CO2条件下培养，隔天更换培养液，待细胞融合至贴壁，胰酶消化传代培养。取对数生长期细胞，使用PBS进行洗涤2次，调整细胞密度为1×106个/mL，接种至6孔板，2 mL/孔，待细胞融合至贴壁，按照LipofectamineTM3000试剂盒说明书操作，将CASC11过表达质粒CASC11 mimics转染至U87-MG细胞，6 h后更换为不含双抗的DMEM培养基，继续培养至48 h，收集细胞用于后续实验。另取U87-MG细胞按照上述步骤进行培养，但不进行转染。

1.4 实时荧光定量PCR检测转染后细胞中CASC11 mRNA的表达情况 取未转染和转染48 h后的U87-MG细胞，使用PBS洗涤后，采用TRIzol法提取细胞总RNA，随后反转录合成cDNA，以GAPDH为内参检测CASC11 mRNA的表达水平。配制反应体系：双倍核酸染料10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板cDNA 2 μL，双蒸水补足至总体积为20 μL。扩增条件：94 ℃预变性40 s；95 ℃变性8 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，重复40个循环。实验所用引物：CASC11上游引物为5′-GCTGCAGAAGGTCCGAAGAA-3′，下游引物为5′-TTCACCACGTCCAGTTGCTT-3′；GAPDH上引物游为5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物为5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。采用2-△△Ct法计算各待测基因的相对表达量。设置5个复孔，实验重复3次，取均值。

1.5 建立脑胶质瘤原位荷瘤裸鼠模型 参考文献[5]进行建模。取全部BALB/c裸鼠，采用随机数字表法选取10只设为空白组，右腋皮下注射生理盐水0.1 mL。其余35只建立脑胶质瘤原位荷瘤模型，随机选取25只裸鼠，给予右腋皮下注射未转染的U87-MG细胞悬液0.1 mL(细胞密度为1×108个/mL)，以瘤体积100 mm3左右为建模成功标准，建模成功20只，剔除不合格裸鼠5只，再采用随机数字表法将这20只裸鼠分为脑胶质瘤组、青藤碱组各10只。给予剩余10只裸鼠右腋皮下注射转染48 h后的U87-MG细胞悬液0.1 mL(细胞密度为1×108个/mL)，设为mimics联合青藤碱组，均建模成功。

1.6 干预方式 参考文献[6]进行干预。建模后7 d，给予青藤碱组、mimics联合青藤碱组裸鼠腹腔注射青藤碱生理盐水溶液(经生理盐水稀释后浓度为1.2 mg/mL)20 mg/kg，空白组、脑胶质瘤组腹腔注射等量生理盐水，1次/d，持续14 d。

1.7 组织取材及抑瘤率和脾脏指数的测定 干预结束后次日，称取裸鼠重量，通过腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉裸鼠后将其脱颈处死，迅速剥离肿瘤块，称取其重量，计算抑瘤率，抑瘤率=(脑胶质瘤组肿瘤重量-干预组肿瘤重量)/脑胶质瘤组肿瘤重量×100%。取部分脑胶质瘤组织分成两份，一份置于预冷的40%中性甲醛固定24 h，常规脱水、石蜡包埋，使用切片机将其切为厚度4 μm的连续切片，用于免疫组织化学染色；另一份置于液氮中保存，用于蛋白检测。开腹分离出脾脏，生理盐水冲去残留血液后，用滤纸吸干水分并称重，计算脾脏指数，脾脏指数=脾脏质量(mg)/体质量(g)。

1.8 免疫组织化学染色法检测微血管密度 取胶质瘤组织切片，经二甲苯脱蜡、PBS洗涤后，加入3%过氧化氢溶液浸泡10 min，然后加入抗原修复液1 mL，微波抗原修复，冷却至室温，蒸馏水漂洗，滴加5%胎牛血清5 mL封闭孵育20 min，弃去血清，加入兔抗人CD31一抗(1 ∶500)2 mL，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤2次，加入二抗(1 ∶2 000)1 mL，37 ℃孵育20 min，PBS洗涤2次。二氨基联苯胺显色，蒸馏水冲洗，苏木精复染，常规脱水，封片剂封片，随机选取5个不重复视野，以棕黄色单个内皮细胞或细胞群作为一个血管，记录每个视野的血管数量，计算5个视野的均值，以每个视野平均血管数量表示血管密度。

1.9 Western blot检测肿瘤组织AKT3蛋白的表达量 取在液氮中保存的胶质瘤组织，用眼科剪剪碎后，于研磨器中研磨，加入RIPA裂解液2 mL，转移至离心管，4 ℃ 10 000 r/min离心8 min(离心半径12 cm)，取其上清，采用二喹啉甲酸法测定总蛋白并定量。取50 g待测蛋白，加入5倍体积上样缓冲液混匀，水浴加热沸腾5 min，相同条件下离心取上清，恒定电压下行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿法转膜，封闭液封闭2 h，混合兔抗小鼠AKT3一抗(1 ∶5 000)、GAPDH一抗(浓度1 ∶500)各1 μL，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜，与1 μL二抗(1 ∶2 000)混合，室温孵育1 h，TBST洗膜，发光液显色，暗室曝光，经凝胶成像系统扫描分析，AKT3蛋白相对表达量=AKT3条带灰度值/内参GAPDH灰度值。

1.10 统计学分析 采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用两样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 未转染和转染细胞中CASC11 mRNA的表达量的比较 未转染U87-MG细胞、转染48 h后U87-MG细胞中CASC11 mRNA的表达量分别为(0.21±0.03)、(0.98±0.12)，转染24 h后U87-MG细胞的CASC11表达量高于未转染U87-MG的细胞(t=13.920，P<0.001)，提示转染成功。

2.2 青藤碱组和mimics联合青藤碱组抑瘤率的比较 mimics联合青藤碱组、青藤碱组的抑瘤率分别为(30.29±4.46)%、(52.10±6.87)%，前者低于后者(t=8.420，P<0.001)。

2.3 4组裸鼠脾脏指数的比较 与空白组比较，脑胶质瘤组的脾脏指数降低(P<0.05)；与脑胶质瘤组比较，青藤碱组的脾脏指数升高(P<0.05)；与青藤碱组比较，mimics联合青藤碱组的脾脏指数降低(P<0.05)。见表1。

2.4 4组裸鼠肿瘤微血管密度的比较 与脑胶质瘤组比较，青藤碱组的微血管密度降低(P<0.05)；与青藤碱组比较，mimics联合青藤碱组的微血管密度升高(P<0.05)。见表1和图1。

表1 4组裸鼠脾脏指数和肿瘤微血管密度的比较(x±s)

图1 各组荷瘤裸鼠肿瘤微血管生成情况(免疫组织化学染色，×400，标尺25 μm)

2.5 各组荷瘤裸鼠肿瘤组织AKT3蛋白表达量的比较 与脑胶质瘤组比较，青藤碱组AKT3蛋白的表达量降低(P<0.05)；与青藤碱组比较，mimics联合青藤碱组AKT3蛋白的表达量升高(P<0.05)。见图2和表2。

图2 Western blot检测肿瘤组织AKT3蛋白表达量

表2 各组荷瘤裸鼠肿瘤组织AKT3蛋白的相对表达量(x±s)

3 讨 论

脑胶质瘤是起源于神经外胚叶组织的中枢神经系统恶性肿瘤，其深入脑组织呈浸润性生长，与正常组织无明显分界点[7]。脑胶质瘤的临床表现为颅内压增高、视力下降、头痛、呕吐，部分患者出现癫痫症状[8]。目前其发病机制尚未完全阐明，多认为与基因突变、细胞信号通路改变等有关[9]。脑胶质瘤的浸润生长与内部大量新生血管的生成密切相关，是脑胶质瘤发展及复发的主要原因之一，脑胶质瘤细胞可分泌大量血管内皮生长因子，增强血管内皮细胞有丝分裂，加快血管生成[10]。因此，寻找有效抑制肿瘤血管生成的药物或手段，对于改善患者预后、降低病死率与复发率具有重要意义。

中医认为脑胶质瘤属于“积症”“眩晕”“癫狂”范畴，是风、火、痰、瘀、湿多种病理因素共同作用的结果，其主要病机为外感风毒、肝肾不足、正气虚弱，以致风痰瘀血于脑络、积毒脑内、肿大成块终而发病，故治疗上应以祛风扶正为主[11]。中医青风藤取自防己科植物青藤的干燥藤茎，性平，味苦、辛，归肝经、脾经，可除湿、祛风、行气、利水。《浙江天目山药植志》记载，青风藤可治风水肿、脚气、风湿、关节疼痛、口眼歪斜，痈肿恶疮[12]。青藤碱是一种活性生物碱，Ik等[13]在观察其对慢性哮喘小鼠的治疗作用时发现，青藤碱可抑制血管生成，并调节Th2相关免疫反应。脾脏是机体重要的外周免疫器官，是免疫应答反应的主要部位，脾脏指数可反映机体的免疫功能状态[14]。血小板内皮细胞黏附分子CD31参与肿瘤细胞对内皮细胞的黏附过程，是一种稳定性较高的血管内皮细胞标志物，可作为恶性肿瘤免疫组织化学实验的常规指标[15]。因此本研究选取脾脏指数和基于CD31标记的微血管密度作为观察指标。结果显示，脑胶质瘤组的脾脏指数较空白组降低(P<0.05)，提示胶质瘤原位荷瘤裸鼠的免疫功能降低；而给予青藤碱干预后，胶质瘤原位荷瘤小鼠的抑瘤率为(52.10±6.87)%，且脾脏指数升高、微血管密度降低(均P<0.05)，提示青藤碱可提升脑胶质瘤裸鼠的免疫功能、抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长，具有一定的抗脑胶质瘤作用。

CASC11是一种长链非编码RNA，其作为一种致癌基因高表达于多种恶性肿瘤，参与调节多个细胞通路，在肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡等过程中发挥重要作用，常作为恶性肿瘤的潜在治疗靶点及预后评估的标志物[16]。AKT3是AKT家族亚型之一，作为磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的下游效应因子，可被PI3K1活化，活化后的AKT3可磷酸化AKT残基的底物，间接激活其下游蛋白因子，从而与其共同作用参与肿瘤组织血管生成的调节[17]。Ma等[18]研究认为，过表达AKT3可促进癌细胞生长，消除G0/G1期的细胞周期停滞，增强其增殖及迁移能力，从而促进结肠癌发展，提示AKT3可促进恶性肿瘤生长。本研究结果显示，与青藤碱组比较，mimics联合青藤碱组的抑瘤率、脾脏指数降低，微血管密度升高，提示过表达CASC11可削弱青藤碱抑制脑胶质瘤血管生成及肿瘤生长、改善免疫功能的作用。此外，青藤碱组AKT3蛋白的表达量低于脑胶质瘤组，而mimics联合青藤碱组AKT3蛋白的表达量反而高于青藤碱组(P<0.05)。这提示青藤碱可能通过抑制CASC11的表达来下调AKT3蛋白的表达，从而发挥其抑瘤作用。

综上所述，青藤碱可提升脑胶质瘤原位荷瘤裸鼠的免疫功能，抑制肿瘤血管生成，其可能通过抑制CASC11表达进而下调AKT3蛋白表达来发挥作用。然而，本研究存在一定不足，如仅检测了正常裸鼠的脾脏指数进行比较，未取正常裸鼠脑组织检测微血管密度及AKT3蛋白表达量，今后将进一步完善实验设计以验证所得结论。