肾透明细胞癌细胞焦亡相关基因预后模型的建立与应用

毛 伟，张 琳，刘清钊

（1.重庆市南岸区人民医院药剂科，重庆 400060；2.陆军军医大学第一附属医院药剂科，重庆 400038；3.重庆市南岸区人民医院肾内科，重庆 400060）

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是最常见的恶性肿瘤之一，在男性恶性肿瘤中排名第6，在女性恶性肿瘤中排名第9[1]。肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是肾癌中最常见的亚型，其发病率占肾癌的70%～80%[2]。ccRCC 的病理生理学很复杂，除了肥胖、吸烟、高血压和糖尿病等因素外，还有多种基因突变[3]。因此，建立可以准确预测ccRCC 患者预后的工具用于指导临床诊治至关重要。细胞焦亡（pyroptosis）又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡[4]。焦亡细胞以细胞肿胀和许多泡状突起为特征，在电子显微镜下，可以看到其首先形成大量的囊泡，当这些囊泡形成后，细胞膜上就会形成孔洞，孔洞破裂，内容物流出[5]。细胞焦亡主要依靠caspase 家族的部分蛋白，活化caspase 后裂解gasdermin 蛋白，促进炎症小体的转录和表达以及IL-1β、IL-18 等炎症因子的分泌，最终导致细胞死亡[6]。细胞焦亡最初被发现是抵抗感染的关键机制，越来越多的研究表明，它在肿瘤的发展中也起着重要作用。有研究报道[7]，炎性小体、gasdermin 蛋白和炎症因子与肿瘤的发生、侵袭和转移有关。细胞焦亡在肿瘤的发生和抗肿瘤过程中起着重要的作用，但其在ccRCC 中的具体作用研究较少。因此，本研究拟建立焦亡相关评分模型，探讨ccRCC 中细胞焦亡、预后、免疫微环境以及免疫治疗之间潜在的相关性。

1 材料与方法

1.1 数据来源 从TCGA 数据库下载509 例ccRCC及71 例癌旁正常组织的转录组数据和临床数据，剔除年龄、性别、生存状态、病理分期缺失以及生存时间小于30 d 的样本，从ICGC 数据库中下载转录组数据及临床数据进行验证。

1.2 细胞焦亡相关基因的鉴定 利用“edgeR”包筛选ccRCC 与癌旁组织之间的差异表达基因（DEGs），筛选条件：|Log2FC|＞1，FDR＜0.05。从GO、MSigDB 数据库及先前的研究[8-13]中共获取到58 个焦亡基因，差异焦亡基因为58 个焦亡基因与DEGs 的交集。

1.3 一致性聚类 利用“ConsensusClusterPlus”包对差异焦亡基因矩阵进行一致性聚类，聚类值k 取2～6，根据聚类效果选择具有较高聚类稳定性的k 值。

1.4 富集分析 以“c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt”为参考基因集进行基因集变异分析（GSVA）、基因集富集分析（GSEA）。FDR＜0.01 表示差异有统计学意义。

1.5 肿瘤微环境（TME）细胞浸润 采用“CIBERSORT”“quanTIseq”算法来定量免疫细胞的比例，应用“ESTIMATE”包评估肿瘤纯度。

1.6 焦亡相关评分模型的建立与评估 利用“edgeR”包筛选ccRCC 聚类簇间的DEGs，筛选条件：|Log2FC|＞1，FDR＜0.05。然后对DEGs 进行单因素Cox 回归、多因素Cox 回归和LASSO 回归分析筛选焦亡相关基因并构建风险评分模型：

其中Gi、βi分别代表模型中基因表达水平及系数。

根据公式计算出每个ccRCC 患者的风险评分，利用“survminer”包确认最佳截止点将患者分为高、低风险两组并进行Kaplan-Meier 生存曲线分析，应用“timeROC 包”进行ROC 曲线分析，评估模型的稳定性。结合临床数据和风险评分，利用“regplot”包绘制列线图、校准曲线评估模型的预测能力。

2 结果

2.1 差异焦亡基因的鉴定 共发现4179 个DEGs，见图1A。DEGs 与58 个细胞焦亡基因取交集筛选出了23 个上调和1 个下调的差异焦亡基因，见图1B、图1C；KEGG 分析结果显示，差异焦亡基因主要富集在NOD 样受体信号通路、TNF 信号通路等炎症通路以及沙门氏菌感染、军团菌病等感染性疾病相关通路，见图1D。

图1 差异焦亡基因的筛选

图1 差异焦亡基因的筛选（续）

2.2 基于差异焦亡基因的肿瘤分型 为研究24 个差异焦亡基因表达水平与ccRCC 亚型之间的关系，对ccRCC 患者进行一致性聚类分析，当k=2 时，组内相关性最高而组间相关性最低，确定了两种不同的ccRCC 亚型，其中聚类簇1 包含252 例患者，聚类簇2 包含257 例患者，见图2A；Kaplan-Meier 生存分析显示，聚类簇1 生存优势显著高于聚类簇2，见图2B。为了探索2 种亚型间的信号通路差异，进行GSVA 分析，结果显示：聚类簇1 在代谢相关通路中富集，主要包括丁酸代谢、丙酸代谢、氧化磷酸化、三羧酸循环；聚类簇2 在免疫相关通路中富集，主要包括NOD 样受体信号通路、Toll 样受体信号通路、B细胞受体信号通路、T 细胞受体信号通路，见图2C。

图2 细胞焦亡基因相关的肿瘤亚型

2.3 两种ccRCC 亚型在TME 细胞浸润上的差异 通过分析两种ccRCC 亚型在TME 细胞浸润情况，发现M2 巨噬细胞、单核细胞、NK 细胞、幼稚B 细胞、静息肥大细胞、静息CD4+记忆T 细胞、激活的树突状细胞主要富集在聚类簇1 中，而聚类簇2 富含调节性T 细胞、B 细胞、浆细胞、激活的CD4+记忆T细胞、γδT 细胞、CD8+T 细胞，见图3A、图3B；基质评分、免疫评分、ESTIMATE 评分结果显示，聚类簇1评分均低于聚类簇2，见图3C。

图3 两种ccRCC 亚型在TME 上的差异

2.4 焦亡相关评分模型的建立与验证 对两种ccRCC 亚型的差异进行分析，确认了1096 个DEGs，通过单因素和多因素Cox 回归，筛选出248 个可作为独立预后特征的基因；进行LASSO 回归，确认了10个焦亡相关基因用于构建风险评分模型，见图4A、图4B；预后风险评分=1.0518×C10orf90+0.0845×HS3ST3A1 +0.0407 ×SAA1 -0.324 ×MPP7 +0.2061 ×IGF2BP3 +0.0566 ×ADAMTS14 +0.2176 ×CILP -0.0119×SHOX2-0.1069×TRIM2+0.3367×HHIPL2。根据上述公式，计算每个患者的风险评分，并将患者分为高风险组和低风险组，最佳截止值为0.9562，结果显示，低风险组较高风险组有生存优势，见图4C、图4D，其中1、3、5 年生存率的AUC 预测值分别为0.77、0.727、0.764，见图4E。为了验证预后模型的预测能力，从ICGC 数据库下载ccRCC 的转录组数据和临床数据，根据风险评分公式，将患者分为高低风险两组，最佳截止值为1.9869，见图4F、图4H；患者1、3、5 年生存率的 AUC 预测值分别为0.774、0.747、0.762，见图4G。

图4 构建风险评分模型

2.5 风险评分与患者临床病理因素的关系 结果显示，风险评分在肿瘤负担较重、肿瘤体积较大、淋巴结受累较重、远端转移、病理分期较晚、组织学分级较晚的男性患者中显著增高，见图5。

图5 风险评分与临床病理关系

2.6 风险评分与ccRCC 患者预后的关系 单因素Cox 回归分析显示，高龄、进展期病理分期、较大的肿瘤体积、较重淋巴结受累、远处转移、高风险评分是影响患者总生存期的不利因素；多因素Cox 回归分析显示，年龄、病理分期、风险评分是患者预后的独立影响因素，见表1。进一步验证风险评分对ccRCC 患者的预后价值，以年龄、病理分期、风险评分构建列线图，见图6A；结果显示，预测与实际的生存概率有较好的一致性，见图6B；预测总生存期的C 指数为0.7714（95%CI：0.7534～0.7894）；患者1、3、5 年生存率的AUC 预测值分别为0.872、0.803、0.752，见图6C。

图6 风险评分对ccRCC 患者的预后价值

表1 单因素和多因素Cox 回归分析

2.7 GSEA、GSVA 富集分析 GSEA、GSVA 富集分析显示，高风险组主要富集在趋化因子信号通路、产生IGA 的肠道免疫网络、细胞因子受体相互作用等免疫相关通路，低风险组主要富集在三羧酸循环、丙酸代谢、脂肪酸代谢、缬氨酸亮氨酸异亮氨酸降解等代谢相关通路，见图7。

图7 GSEA、GSVA 富集分析

2.8 高风险组与低风险组在TME 细胞浸润上的差异 ESTIMATE、CIBERSORT 和quanTIseq 算法显示，高风险组的基质评分、免疫评分较高，见图8A，但高风险组含有更高水平的免疫抑制细胞如巨噬细胞、调节性T 细胞，见图8B。

图8 高风险组与低风险组免疫细胞浸润差异

2.9 风险评分预测免疫治疗效果的价值 高风险组体细胞突变高于低风险组，见图9A、图9B，通过比较高风险组与低风险组免疫检查点（PD-1、PD-L1、CTLA4、LMTK3、LAG3、TIGIT、CD27、OX40、GITR、ICOS）的基因表达水平发现，高风险组基因表达水平普遍高于低风险组，见图9C；通过ImmuCellAI 数据库预测高低风险组对免疫治疗的反应，结果显示，低风险组的反应率更高，见图9D。

图9 风险评分预测免疫治疗效果的价值

3 讨论

细胞焦亡是机体重要的免疫反应，在拮抗感染和内源性危险信号中发挥重要作用。研究表明[14]，细胞焦亡在肿瘤的生长中起着双向作用，一方面炎性体可以诱导肿瘤细胞发生焦亡，抑制肿瘤细胞的增殖；另一方面，炎性体的累积效应也可以形成适宜肿瘤细胞生长的微环境，起着促瘤生长的作用。然而，有关细胞焦亡与ccRCC 的预后、免疫微环境的研究较为有限，需要进一步深入研究。

本研究对TCGA 数据库中ccRCC 的焦亡基因进行差异表达分析，获取到24 个差异焦亡基因。基于上述差异焦亡基因进行一致性聚类分析得到2 个亚型，聚类簇1 生存优势显著高于聚类簇2。GSVA分析表明，聚类簇1 主要富集在代谢相关通路，聚类簇2 主要富集在免疫相关通路。为了进一步评估焦亡相关基因与ccRCC 的关系，本研究基于两个亚型的差异基因进行单因素、多因素Cox 回归及LASSO回归分析构建1 个风险评分模型，发现低风险组生存优势高于高风险组（P＜0.001），并在ICGC 数据库中进行了验证，说明风险评分是ccRCC 预后的独立危险因素。包含风险评分、年龄及病理分期的列线图显示，在预测ccRCC 生存概率方面，AUC 较高（1、3、5 年分别为0.872、0.803、0.752）。风险评分与肿瘤大小、淋巴结转移、远端转移、病理分期、组织学分级呈正相关，基于这一特征，高风险组表现出更具侵袭性的生物学行为。此外，高风险组肿瘤细胞存在免疫抑制表型，巨噬细胞和调节性T 细胞浸润较多。最后，还对免疫治疗反应进行了预测，发现低风险组的反应率更高。以上结果表明，风险评分可用于ccRCC 患者预测预后。

本研究筛选出10 个焦亡相关基因（C10orf90、HS3ST3A1、SAA1、MPP7、IGF2BP3、ADAMTS14、CILP、SHOX2、TRIM2、HHIPL2），这10 个基因表达情况与ccRCC 预后相关。研究发现，TRIM2、MPP7表达越高ccRCC 患者预后越好（P＜0.001），C10orf90、HS3ST3A1、SAA1、IGF2BP3、ADAMTS14、CILP、SHOX2、HHIPL2 表达越高ccRCC 患者预后越差（P＜0.001）。TRIM2 作为一种抗肿瘤基因，其过度表达显著抑制了RCC 迁移和侵袭能力，在ccRCC中起负调控作用[15]。New M 等[16]研究表明，MPP7 是一种参与细胞接触的脚手架蛋白，其高表达引起胰腺导管腺癌细胞自噬，导致癌细胞死亡。目前在CILP 癌症中的作用尚不清楚。SHOX2 异常表达导致上皮间质转化（EMT），SHOX2 可能通过TGF-β信号通路调节EMT 来促进人膀胱癌细胞的迁移、侵袭[17]。TRIM 家族蛋白在发育、凋亡、自噬、炎症、先天免疫及癌变等多种生物过程中具有广泛的作用[18]。C10orf90 是位于DNA 损伤高敏位点的抑癌基因，可激活p53-p21 通路抑制肿瘤发生[19]。HS3ST3A1 是一种新的肿瘤调节因子，因肿瘤表型的不同可发挥抑癌或促癌作用[20]。SAA1 可能参与肿瘤的发生发展，促进胰腺癌的进展和远处转移[21]。Lin YM 等[22]研究结果表明，ADAMTS14 在口腔鳞状细胞癌中低表达，并调节口腔鳞状细胞癌中的细胞存活，且其表达是口腔鳞状细胞癌患者的独立预后标志物。HHIPL2是一种跨膜蛋白，HHIPL2 的表达水平与胃癌显著相关。微阵列分析和qRT-PCR 验证发现胃癌样本中HHIPL2 的表达水平高出正常组织7.4 倍[23]。研究表明[24]，IGF2BP3 不仅在多种肿瘤组织中表达上调，还在一些癌前病变如巴雷特食管、非典型子宫内膜异位症中表达上调。

本研究仍然存在一些不足：首先，预后模型与ccRCC 的发生、发展的关系仍需体外和体内实验进一步验证，以更好地评估预后模型和ccRCC 之间的关系；其次，本研究数据来自TCGA 数据库，对其他人群的适用性尚不明确。但建立的预后模型可有效预测ccRCC 患者的预后，可能对指导临床治疗、制定精准治疗方案具有重要价值。

综上所述，ccRCC 焦亡相关基因预后模型可用于预测ccRCC 患者的预后，可以作为免疫治疗反应的预测指标，有利于进一步指导临床治疗。