兰州地区腹泻患儿沙门菌耐药性与分子分型分析

申艳琴，董 锟，张 璟，兰 光，张 阳，李欣颖，闫 静，刘小菊，权玉玲

沙门菌广泛分布于自然环境中，是一种重要的食源性致病菌，也是常见的人兽共患病原菌，可感染人和多种哺乳动物。人类主要是通过摄入被沙门菌污染的水和食品，导致食物中毒及肠道疾病的发生，可能引起食源性疾病的暴发。沙门菌是全球食源性腹泻疾病的主要致病菌[1-2]，我国每年腹泻病中70%以上是由沙门菌感染引起的[3]，尤其是婴幼儿细菌性腹泻中沙门菌感染居首位[4]。

迄今为止，已发现的沙门菌血清型有2 600多种[5]，其中非伤寒沙门菌是引起儿童感染性腹泻疾病中最常见的病原菌[6]。近年来随着抗生素的广泛使用，全球范围内沙门菌耐药现象日益严重，已成为世界性的公共卫生问题[7-8]，耐药菌株的流行增加了对抵抗力较弱的婴幼儿临床治疗难度。本研究对兰州市2018-2020年哨点医院收集的腹泻患儿粪便标本进行血清学分型及药敏试验，并结合PFGE分型技术对菌株进行同源性分析，为沙门菌引起的腹泻病临床诊疗和溯源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 2018-2020年兰州市哨点医院腹泻患儿粪便标本中分离的149株沙门菌菌株。

1.2 仪器与试剂 Vitek 2 Compact 全自动微生物鉴定仪(法国生物梅里埃公司)或PhoenixTM全自动细菌鉴定仪(美国BD公司)，脉冲场电泳仪、Gel Dol XR 凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

沙门菌显色培养基(法国科玛嘉公司)、XLD(美国BD公司)，Swarm Agar(北京路桥公司)，沙门菌诊断血清(丹麦SSI公司，泰国S&A公司)，革兰氏阴性菌药敏检测板(上海星佰生物技术有限公司)，限制性内切酶XbaI(美国New England Biolabs公司)，蛋白酶K(Amresco)，大肠埃希标准菌株(ATCC 25922)，沙门菌标准菌株(ATCC H9812)。

1.3 检测方法 根据国家《食源性疾病监测工作手册》，将哨点医院上送的可疑菌株经选择性平板分离后纯化，并使用全自动微生物鉴定仪进行系统生化鉴定。采用《沙门菌属血清型诊断》中玻片凝集方法，确定对应血清型。按照美国临床和实验室标准化协会推荐的微量肉汤稀释法对菌株最低抑菌浓度进行药敏测定。根据美国PulseNet沙门菌PFGE生物标准方法对沙门菌分子分型，H9812作为质控菌株。

2 结 果

2.1 沙门菌流行特征 2018-2020年从腹泻患儿粪便中检出149株沙门氏菌，其中2018年检出32株，2019年检出65株，2020年检出52株。感染季节分布以夏秋季(5-10月)为主，占全年的90.60%(135/149)。患儿年龄分布以1～3岁的幼儿居多，占59.73%(89/149)；其次为1岁以下的婴儿，占20.81%(31/149)；3～6岁幼儿及6岁以上的儿童依次占12.08%(18/149)、7.38%(11/149)。

2.2 沙门菌血清型分布 149株沙门菌共鉴定出33个血清型，以D群和B群为主，分别占46.31%和37.58%。其中肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌为流行的主要血清型别，分别占30.87%和28.19%，见表1。

表1 沙门菌血清型分布Tab.1 Salmonella serotype distribution

2.3 沙门菌耐药特征 药敏试验结果显示95.97%(143/149)沙门菌对14种抗生素存在不同程度的耐药，其中氨苄西林耐药率(79.87%)最高，四环素(65.10%)、萘啶酸(59.73%)、头孢唑啉(52.35%)、氨苄西林/舒巴坦(46.31%)的耐药率均在45%以上；对亚胺培南和头孢西丁较敏感，敏感率分别为95.30%和93.96%，见表2。

表2 沙门菌对各种抗生素的耐药情况Tab.2 Drug resistance of Salmonella to various antibiotics

两种优势血清型肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌除对亚胺培南敏感外，对其他抗生素均有耐药性，耐药率分别为97.82%(45/46)、97.62%(41/42)。肠炎沙门菌主要耐受萘啶酸、氨苄西林、头孢唑啉，耐药率分别为93.40%、84.70%、52.40%；鼠伤寒沙门菌主要耐受四环素、氨苄西林，耐药率分别为92.80%、85.70%，见图1。

图1 沙门菌对各种抗生素的耐药率Fig.1 Resistance rate of Salmonella to various antibiotics

149株沙门菌有117株为多重耐药，多重耐药率为78.52%，共产生78个多重耐药谱。其中鼠伤寒沙门菌有29个多重耐药谱，多重耐药率为80.95%(34/42)，5种及5种以上的耐药菌株占到50.00%(21/42)，发现1株鼠伤寒沙门菌对12种抗生素耐药(CIP-CHL-NAL-GEN-TET-CTX-AMP-AMS-CAZ-CFZ-AZM-SXT)；肠炎沙门菌有19个多重耐药谱，多重耐药菌率为76.09%(35/46)，优势耐药谱为NAL-AMP-AMS-CFZ。

2.4 PFGE分型及聚类分析 对肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌2种优势血清型的分离株经限制性内切酶XbaⅠ进行PFGE分型分析。按照图谱经BN软件聚类分析，38株肠炎沙门菌分为20个带型(SE1～SE20)，包含2株及以上带型有6种，分别是SE12(6株，来自2018年、2019年、2020年)、SE10(5株，来自2018年、2020年)、SE1(4株，来自2020年)、SE7(2株)、SE6(2株)、SE9(2株)、SE11(2株)见图2；31株鼠伤寒沙门菌分为30个带型，ST1带型包含2株菌，见图3。

图2 肠炎沙门菌脉冲场电泳聚类分析图谱Fig.2 Cluster analysis of S.enteritidis by pulsed field electrophoresis

图3 鼠伤寒沙门菌脉冲场电泳聚类分析图谱Fig.3 Cluster analysis of S.Typhimurium by pulsed field electrophoresis

3 讨 论

感染性腹泻是儿童常见疾病之一，尤其是婴幼儿消化系统尚未发育成熟，免疫功能不完善，抵抗力较弱，极易引起沙门菌感染。本研究发现在149例由沙门菌引起的腹泻患儿中1～3岁幼儿检出率最高(59.73%)，与深圳监测情况一致[9]，与河南、玉林略有不同[10-11]，感染季节多发生于夏秋季。本次分离的沙门菌血清型以肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌为主，与上海、安徽地区流行优势血清型一致[12-13]。

随着抗生素在临床治疗和畜牧业的广泛应用，沙门菌的耐药性及耐药种类不断增加。本研究显示，兰州地区腹泻患儿分离出的沙门菌对各类抗生素的耐药率总体略高于全国水平，其中氨苄西林、四环素、萘啶酸耐药较严重，第一代头孢类抗生素耐药率高于第二代、第三代，这与河南、成都报道相似[10]。 环丙沙星的耐药率为18.12%，但它的中敏率却高达57.72%，喹诺酮类抗菌药物的耐药趋势不断上升，为小儿慎用药物，治疗沙门菌感染患儿建议不考虑此类药物。通过对优势血清型沙门菌的耐药结果分析，发现肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌除了对亚胺培南敏感外，对其他抗生素耐药性各有不同。肠炎沙门菌对萘啶酸高度耐药，而鼠伤寒沙门菌对四环素高度耐药，建议结合血清型及药敏结果对感染沙门菌患儿进行临床抗菌药物治疗。

在本次研究中，虽未出现ESBL菌株，但多重耐药较为严重，多重耐药率高达78.52%。尤其是鼠伤寒沙门菌，多重耐药率为80.95%，5种及以上抗生素耐药株占50.00%，其中1菌株耐受12种抗生素。肠炎沙门菌多重耐药率为76.09%，优势耐药谱为CHL-NAL-TET-AMP-AMS-CFZ-SXT。本次研究中还发现5株沙门菌同时耐受喹诺酮类药物和头孢类药物，而这两类药物是目前临床治疗沙门菌引起腹泻感染首选药物。以上菌株引起的多重耐药不仅给患儿的临床治疗带来困难，还极易引起食源性疾病的暴发。因此，应加强对沙门菌耐药性的监测，了解其变迁趋势，合理使用抗菌药物，预防多重耐药株的出现和流行。

本研究采用细菌分型的“金标准”[14]PFGE分子分型，对2种优势血清型沙门菌分型进行分析，发现肠炎沙门菌同源性较高，有3个优势带型。SE12带型的6株菌来自2018年(1株)、2019年(1株)、2020年(4株)3个不同年份患儿粪便标本，显示此型别污染源持续存在，其中2020年4株菌分离时间非常接近，可能存在沙门菌小范围潜在暴发。鼠伤寒沙门菌有30个带型，型别相对分散，分布呈多样性。因而需加强对婴幼儿病例监测，进行溯源分析，掌握PFGE优势带型，完善防控措施，防止食源性疾病暴发。

本次研究对兰州市腹泻患儿沙门菌进行了血清学分型和耐药特征分析，建立沙门菌分子分型数据库，为感染沙门菌腹泻患儿临床用药提供参考，防止多重耐药的发生，有利于追踪溯源。

利益冲突：无

引用本文格式：申艳琴，董锟，张璟，等. 兰州地区腹泻患儿沙门菌耐药性与分子分型分析[J].中国人兽共患病学报，2022，38(7)：626-630，637. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.087