CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在原发眼附属器MALT淋巴瘤患者中的表达及临床意义

李 鑫 杨 磊 叶 进 丛 佳 魏立强 姚 娜 杨 晶 崔雪莹 王景文

黏膜相关淋巴组织边缘区淋巴瘤(marginal zone mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma， MALT)是发生于B淋巴细胞的一类惰性淋巴瘤，好发于结外，包括胃肠道、眼附属器、肺等组织器官的黏膜相关淋巴组织[1]。原发眼附属器MALT淋巴瘤(ocular adnexal MALT，OAML)定义为原发于眼附属器的MALT淋巴瘤，多数表现为眼附属器局灶性病变，包括眼眶、结膜、眼睑、泪腺等部位，仅少数发生全身多部位受累[1，2]。但因为病灶隐匿，往往被患者忽视，延误病情，影响疾病的预后。

调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是抑制性T细胞的一种功能亚群，约占外周血CD4+T细胞数的1%～10%，Foxp3是Treg细胞的标志[3，4]。Treg细胞具有免疫调节和免疫抑制两大功能，在实体瘤的肿瘤细胞生长、增殖过程中发挥关键作用，因此，对肿瘤的临床进程、预后具有一定的预测作用[5，6]。然而，Treg细胞在血液系统肿瘤中的预测作用仍存在争议。目前，国内外研究认为弥漫大B细胞淋巴瘤等侵袭性淋巴瘤患者外周血中Treg细胞数量明显高于正常人[7～11]。但是，关于MALT淋巴瘤患者外周血Treg细胞的研究较少，尚无OAML的相关研究。本研究应用流式细胞仪检测OAML患者外周血Treg细胞计数，并分析其比例与临床分期、预后等因素的相关性，拟为原发于眼附属器MALT淋巴瘤患者的病情监测、预后评估等提供新的血清学指标。

对象与方法

1.研究对象：连续性收录2015年12月～2020年10月在首都医科大学附属北京同仁医院诊断的OAML患者44例。入组标准：所有患者原发病灶均为眼附属器，临床上经病理明确诊断为MALT淋巴瘤，伴或不伴眼附属器以外部位累及。排除标准：①既往曾进行针对MALT淋巴瘤的治疗(除手术以外)；②确诊前曾诊断其他恶性肿瘤；③确诊前曾诊断自身免疫性疾病。所有病例经眼部肿物切除或者活检送检病理，符合2016年WHO淋巴造血组织肿瘤分类标准。收集入组患者的全身体格检查、血液生化指标、影像学检查等临床资料，临床分期采用Ann Arbor分期和眼附属器淋巴瘤美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM分期，预后评估标准采用淋巴瘤国际预后指标(international prognostic index，IPI)评分和MALT 淋巴瘤国际预后指标(MALT lymphoma international prognostic index，MALT-IPI)评分[12]。选取20名常规体检未见异常的健康志愿者作为正常对照。本研究经笔者医院医学伦理学委员会批准(伦理审批号:TRECKY 2015-016)，所有入组患者均已签署知情同意书。

2.主要试剂及仪器：单克隆抗体试剂盒:抗人CD4-FITC流式抗体、抗人CD25-PE-CyTM流式抗体、抗人Foxp3-APC流式抗体均为美国BD公司产品。裂解液、缓冲液和Foxp3破膜剂为美国Beckman Coulter公司产品。本研究使用的流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司制造的FC500型流式细胞仪。

3.实验方法：抽取研究对象EDTA抗凝外周血2ml充分混匀备用。取10μl CD4-FITC及5μl CD25-PE-CyTM抗体加入100μl抗凝外周血中，涡旋振荡混匀，避光孵育20min；加入Foxp3破膜剂A液1ml，涡旋振荡混匀后避光20min，再加入Foxp3破膜剂B液1ml，300×g离心5min，弃上清，加入100μl Foxp3破膜剂B液重悬细胞；加入10μl Foxp3-APC，避光孵育30min，300×g离心5min洗涤1次，弃上清；加入缓冲液500μl，上机分析，记录CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占全部淋巴细胞的比例。

4.治疗方案：根据眼部肿物部位及浸润程度，选择肿物完全切除或者部分切除，一部分患者经眼科手术完全切除肿物无残留病灶，另一部分眼科术后仍有残留病灶。存在残留病灶患者根据病变累及状况、治疗意愿等因素选择等待观察或进行治疗，治疗方案包括局部治疗(单纯放疗)和系统性治疗(单纯化疗、免疫化疗、化疗±放疗、免疫化疗±放疗)。

5.疗效评价：按照Lugano缓解标准分为完全缓解(complete remission，CR)、部分缓解(partial remission，PR)、病情进展(progress disease，PD)和复发。在治疗结束1个月及此后的每6个月进行疗效评价，包括全身体格检查、血液相关指标及MRI、PET/CT等影像学评估。

6.随访：采取门诊检查、住院复查或电话方式进行随访。总生存(overall survival，OS)定义为确诊时间至死亡时间或随访终点，无进展生存(progression-free survival，PFS)定义为确诊时间至病情进展或复发时间。本研究随访终点为死亡或2022年3月,随访时间为17～75个月，中位随访时间为43个月。

结 果

1.临床特征：入组44例患者，其中男性28例，女性16例，男女性别比为1.75，中位发病年龄为60(20～79)岁。所有病例中仅2例伴LDH升高，3例伴B组症状。常见症状包括眼部异物感、眼睑肿胀、无痛性肿块、眼球突出、视力下降等，症状持续时间为1～120个月，中位时间为10个月。IPI评分和MALT-IPI评分低危、中危的患者分别为59.1%和52.3%、40.9%和38.6%，无IPI评分高危患者，MALT-IPI评分高危患者占9.1%。OAML患者中单眼受累29例(65.9%)，34.1%双眼受累。眼部病变部位以眼眶(T2)最常见，共17例(38.6%)；单纯累及结膜(T1)患者5例，占11.4%；9例T4患者中5例累及视神经，2例累及局部皮肤或皮下软组织，1例累及副鼻窦，1例累及鼻腔。13例患者发生眼外组织受累，累及部位包括淋巴结(n=8)、骨髓(n=4)、肺组织(n=3)、皮下软组织(n=3)、胸壁(n=2)，详见表1。

表1 44例OAML患者的临床特征

2.OAML患者与正常对照之间外周血Treg细胞比例的比较：入组44例OAML患者外周血Treg细胞比例为7.63%±3.77%，20例正常对照外周血Treg细胞比例为6.09%±1.02%，两者比较，差异有统计学意义(P=0.015)。

3.不同累及部位OAML患者外周血Treg细胞比例的比较：44例患者根据病变累及部位进行分组，各组患者外周血Treg细胞比例详见表2。双眼受累患者外周血Treg细胞比例为9.22%±5.23%，高于单眼受累患者(6.80%±2.47%)，但两者比较，差异无统计学意义(P=0.108)。病变局限于眼附属器的OAML患者外周血Treg细胞水平为6.56%±2.42%，低于伴有眼外组织受累患者(10.16%±5.13%)，两者比较，差异有统计学意义(P=0.030)。骨髓受累患者外周血Treg细胞比例为15.43%±3.98%，明显高于无骨髓受累患者(6.85%±2.75%)，两者比较，差异有统计学意义(P<0.001),详见表2。

表2 不同累及部位患者外周血Treg细胞比例的比较

4.外周血Treg细胞比例与临床参数的相关性分析：44例OAML患者外周血Treg细胞比例与血清LDH水平、IPI评分、MALT-IPI评分均无相关性(rLDH=-0.149，P=0.334；rIPI=0.120，P=0.437；rMALT-IPI=0.048，P=0.756)。

5.外周血Treg细胞比例与预后的关系：截至2022年3月，44例患者中PD或复发8例，3年OS率、PFS率分别为100.0%、63.0%。取所有入组患者外周血Treg细胞比例的平均值7.63%为临界值，将患者分为低Treg细胞组(28例)和高Treg细胞组(16例)，两组患者的一般临床资料匹配。低Treg细胞组中PD或复发3例，3年OS率、PFS率分别为100.0%、92.9%；高Treg细胞组中PD或复发3例，3年OS率、PFS率分别为100.0%、66.8%，两者比较，差异无统计学意义(P=0.155)，详见图1。

图1 低Treg细胞组和高Treg细胞组PFS的比较

讨 论

MALT淋巴瘤是一种来源于B淋巴细胞的血液系统恶性肿瘤，以异质性浸润为主要特征。临床上常表现为隐匿性淋巴结外无痛性肿物，病程缓慢，疾病初期不容易被发现，往往因影响周围组织或器官功能才就诊[13]。原发于眼附属器的MALT淋巴瘤患者早期多无明显症状，随着肿物逐渐增大而出现相应症状，甚至影响眼部器官功能。眼部症状包括眼球突出、视力下降、头痛等，病史可长达数年。本研究中入组患者就诊前眼部症状持续时间最长可达10年。

CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞是一种特殊的CD4+T细胞亚群，它们通过抑制其他T细胞亚群的激活或增值，在调节免疫反应中发挥重要作用，从而维持免疫系统稳态[14]。Treg细胞不仅在自身免疫性疾病的发展中发挥重要作用，同时也抑制机体的细胞免疫功能，导致肿瘤细胞逃避机体的抗肿瘤作用[15，16]。大量研究表明，在实体瘤和血液系统肿瘤中，外周血Treg细胞比例均明显升高[17～19]。Rollison等[20]在一项关于皮肤鳞状细胞癌的前瞻性研究中发现，外周血中Treg细胞的比例与肿瘤发生的风险正相关，外周血中Treg细胞高表达患者发生皮肤鳞状细胞癌的可能性是表达较低患者的4倍。Chen等[8]研究了77例弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)患者，发现其外周血Treg细胞比例明显高于正常对照，因此推断外周血中较高的Treg比例可能反映了机体免疫抑制状态。本研究也发现OAML患者外周血Treg细胞比例高于正常对照，与上述研究结果一致，提示Treg细胞的免疫逃逸可能在OAML的发病过程中发挥了作用。

OAML是一种临床进程缓慢的惰性淋巴瘤，90%以上患者是以眼附属器局限性病灶为主要表现，仅少数患者发生眼外部位的受累。这种疾病特点很容易让患者甚至医生忽略对于眼外病灶的评估。对于初诊淋巴瘤患者，临床工作中常使用多部位CT或PET/CT等影像学检查，用来评估有无其他组织器官累及。此外，骨髓穿刺作为血液系统疾病常用的有创检查，也被用于判断有无骨髓受累的可能。目前尚未发现简便易行的血清学指标，有利于预估OAML患者的病变累及部位。本研究发现，OAML伴有眼外组织受累的患者外周血Treg细胞比例高于病灶局限于眼附属器患者，尤其是骨髓受累患者外周血Treg细胞比例明显增高，提示Treg细胞比例增高可能与肿瘤的侵袭性相关。Treg细胞升高可能提示机体的免疫机制受损明显，降低了机体对于肿瘤的防御能力，从而导致肿瘤的多部位侵犯。因此，笔者认为对于外周血Treg比例较高的眼附属器MALT患者应该警惕眼附属器以外部位的受累，建议尽早完善全身评估，尤其是骨髓的评估，避免延误病情。

Dehghani等[21]总结了47例经典霍奇金淋巴瘤(classic Hodgkin′s lymphoma，cHL)与48例DLBCL患者发现，外周血Treg细胞比例在诊断开始时显著升高，在一线治疗后降低至正常范围，但在复发/难治患者中显著降低。因此，认为外周血Treg细胞的高水平可能是cHL和DLBCL患者对治疗反应和复发等疾病结局的有利预后因素；推测复发患者外周血中Treg细胞显著减少的一个可能原因是Treg细胞迁移至复发部位，从而在这些患者的肿瘤微环境中高度积累，导致外周血中Treg水平降低。由于本研究为回顾性研究，并未检测治疗后以及病情进展时期外周血Treg细胞比例，因此在进一步的研究中，可以通过检测不同疾病阶段、不同治疗阶段的MALT淋巴瘤患者外周血Treg比例，来探讨其与疾病发生、发展的相关性。

另有研究发现，DLBCL患者中外周血Treg细胞高表达组(>8%)的总生存率高于Treg细胞低表达组(≤8%)，考虑Treg细胞在DLBCL患者中与不良预后相关，证实了Treg细胞在适应性免疫中的抑制作用[8]。本研究结果虽然未发现低Treg细胞组与高Treg细胞组之间的PFS比较，差异有统计学意义，但是笔者观察到低Treg细胞组患者3年PFS率(92.9%)明显高于高Treg细胞组(66.8%)。因此，笔者将在进一步的研究中，通过延长随访时间、扩大样本量等措施，进一步探讨外周血中Treg细胞水平是否可能与OAML的预后有关。

综上所述，本研究发现Treg细胞在OAML疾病过程中发挥了免疫逃逸机制，其比例的增加与肿瘤的侵袭性相关。外周血中较高的Treg细胞水平可能提示眼附属器以外部位受累，尤其是骨髓的受累。因此，OAML患者一旦发现外周血Treg细胞比例增高，应该尽早进行全身评估以明确疾病累及部位。