IL-38在胰腺癌中的表达水平及其临床意义

王 盛 吴 耐 龚 帅 张蓬波 张 冲 张秀忠 任泽强

胰腺癌是一种起源于胰腺导管上皮细胞及腺泡细胞恶性转变的致命性肿瘤，多发于男性和40～85岁人群，在无症状癌症中居首位，具有高侵袭性、高病死率、高发生率特点[1]。因此，积极寻找早期诊断胰腺癌的生物学标志物，对于指导患者的临床治疗及改善预后具有重要意义。白细胞介素(interleukin,IL)-38是新近发现的一类能够抑制炎症作用的细胞因子，其归属于IL-1家族成员，因其能够影响肿瘤微环境进而导致肿瘤细胞逃逸宿主免疫细胞对其杀伤作用，近年来其在肿瘤发生、发展中发挥的作用受到研究者广泛关注[2～5]。既往研究表明，IL-38在乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌等恶性肿瘤中表达异常,并与患者的临床病理资料相关[6～9]。然而，迄今为止国内外关于IL-38在胰腺癌中的研究目前尚无报道。本研究通过分析IL-38在胰腺癌中的表达水平以及与患者临床病理资料的相关性，旨在评价IL-38是否可以作为胰腺癌筛查及评价肿瘤病期及预后的生物学指标，为临床诊疗提供新的思路。

对象与方法

1.一般资料:选取2019年9月～2021年9月于徐州医科大学附属医院普通外科限期行手术治疗的胰腺癌患者(胰腺癌组)62例，收集其临床病理资料、血液标本,其中男性35例，女性27例，患者平均年龄为57.56±10.13岁。另取同期笔者医院健康体检的志愿者55例作为健康对照组，其中男性31例，女性24例，平均年龄为53.65±12.17岁。两组受试者的年龄、性别比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。患者纳入标准:①术后病理证实为胰腺癌;②均为首次治疗;③术前均未行放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗;④临床资料完整。排除标准:①伴有自身免疫性疾病、免疫缺陷病或合并其他器官恶性肿瘤者;②存在全身感染性疾病者;③因其他因素使用免疫抑制和(或)调节剂者;④合并其他胰腺器质性疾病者。对照组纳入标准:①各项体检指标无异常;②半年内无外伤及其他疾病史;③无其他合并症。本研究获得徐州医科大学附属医院医学伦理学委员会的批准,所有受试者均签署知情同意书。

2.酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IL-38水平：使用人IL-38 ELISA试剂盒(美国ProteinTech Group公司)说明书操作来测定IL-38浓度。标本在室温下解冻，再次离心。设置标准孔(8个)和样品孔，每个孔加100μl待测标准品或样品，在37℃孵育2h后，丢弃液体并甩干，向每个孔中加入抗生物素抗体100μl 在37℃孵育箱内孵育50min，洗3次，甩干，加入100μl过氧化物酶标记亲和素工作液，孵育1h。弃液体，将其甩干，板洗5次，并向每个孔中添加90μl的底物溶液37℃孵育20min，然后加入50μl终止溶液终止反应，在450nm处检测每个孔的吸光度(A)值，并自动转换为浓度值。

3.流式细胞术检测外周血单个核细胞(PBMC)中Treg和Th17细胞的表达:采集所有研究对象5ml抗凝静脉血，采用人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司)通过密度梯度离心法分离得到PBMC，一部分PBMC经PBS洗涤离心后加入鼠抗人CD4-FITC抗体，鼠抗人CD25-PE抗体，鼠抗人CD127-Alexa Fluor 647抗体(美国BD公司)，同时设同型对照管，室温避光孵育30min后，采用LSRF ortessa型流式细胞仪(美国BD公司)检测Treg细胞，其表型为CD4+CD25+CD127-。另一部分PBMC加入2μl白细胞活化鸡尾酒(leukocyte activation cocktail)和BD GolgiPlug刺激剂(美国BD公司)，37℃细胞培养箱内孵育6h；流式管收集细胞，加入鼠抗人CD4-BV421抗体(美国BD公司)，室温避光孵育30min后加入固定破膜液固定细胞10min，洗涤离心后加入5μl鼠抗人IL-17A-PE抗体(美国BD公司)，室温避光孵育30min后，采用LSRF ortessa型流式细胞仪(美国BD公司)检测Th17细胞，其表型为CD4+IL-17A+。

结 果

1.两组患者血清IL-38水平比较:胰腺癌组患者血清IL-38为111.97±35.03pg/ml，健康对照组血清IL-38为156.39±36.98pg/ml。两组血清白细胞介素水平比较，差异有统计学意义(t=6.668，P<0.001)，详见图1。

图1 胰腺癌组及健康对照组血清中IL-38的表达水平

2.胰腺癌组患者血清IL-38水平与患者临床病理资料的联系：胰腺癌组患者IL-38水平与不同的肿瘤分期、不同的分化类型以及是否有淋巴结转移有关，差异有统计学意义；与患者年龄、性别、肿瘤直径及肿瘤部位无明显相关性(P>0.05)，详见表1。

表1 IL-38 表达量与胰腺癌组患者临床病理资料的关系

3.两组外周血Treg和Th17细胞表达水平比较:胰腺癌组外周血中Treg细胞表达水平为3.18%±1.36%，健康对照组为4.91%±1.15%，两组比较，差异有统计学意义(t=7.396，P<0.001)，详见图2中A～E。胰腺癌组外周血中Th17细胞表达水平为2.87%±1.08%，健康对照组为2.05%±0.70%，两组比较差异有统计学意义(t=-4.934，P<0.001),详见图2中F～H。

图2 两组外周血Treg细胞和Th17细胞百分率比较A～D.CD4+CD25+CD127-Treg细胞流式细胞术设门图；E.两组外周血Treg细胞百分率柱状图；F～G.CD4+IL-17A+Th17细胞流式细胞术设门图；H.两组外周血Th17细胞百分率柱状图

4.胰腺癌组血清IL-38水平与外周血Treg和Th17细胞表达水平相关性分析:Pearson相关性分析显示胰腺癌患者血清IL-38水平与外周血Treg细胞表达水平呈正相关(r=0.44，P<0.01)，详见图3A；胰腺癌患者血清IL-38水平与外周血Th17细胞表达水平呈负相关(r=-0.45，P<0.01)，详见图3B。

图3 胰腺癌患者血清IL-38表达水平与Treg和Th17细胞相关性分析

5.IL-38对胰腺癌的风险预测价值 ROC曲线分析：血清IL-38为150.65pg/ml时，预测诊断胰腺癌的曲线下面积为0.807(P<0.05)，敏感度为63.6%，特异性为87.1%，详见图4。

图4 ROC曲线结果

讨 论

近年来发现的细胞因子IL-38位于于人类第2号染色体长臂1区4带1亚带，相对分子质量为16.9kDa，由5个外显子组成[10]。在序列上IL-38与IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)高度同源，能够抑制IL-1α和IL-1β表达[11]。研究发现，过表达IL-1α和IL-1β均可促进胰腺癌细胞增殖、侵袭、转移和肿瘤血管形成[12,13]。此外，另一项研究表明，外源性给予IL-1Ra可以抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭,并提高抗肿瘤药物的输送能力[14]。鉴于IL-38与IL-1Ra高度同源，其在功能上同样发挥抑炎作用，那么IL-38是否也参与胰腺癌的发病引起笔者极大的兴趣。本研究结果表明，胰腺癌患者血清IL-38水平低于健康对照组，差异有统计学意义，这提示IL-38很可能在胰腺癌中发挥抗肿瘤作用。此外，本研究还发现IL-38在胰腺癌患者中的表达水平在较晚的肿瘤分期、较差的分化类型以及有淋巴结转移患者中表达水平进一步降低，而肿瘤分期、分级及淋巴结转移是评估胰腺癌患者预后的重要指标，所以本研究结果也间接提示胰腺癌患者血清中IL-38水平可以在一定程度反映患者的预后。

免疫应答反应一直以来是肿瘤学研究的中心问题，肿瘤微环境中免疫细胞的平衡与肿瘤的发生、发展密切相关，其中Th17细胞和Treg细胞一直以来是研究肿瘤免疫的热点，Th17细胞能够促进肿瘤免疫反应，而Treg细胞能够抑制肿瘤免疫反应[15,16]。He等[15]研究发现，用抗体中和Th17细胞分泌的IL-17因子能够抑制野生型小鼠的肿瘤生长，而过表达IL-17则促进了肿瘤的生长。在胰腺癌模型中，Zhang等[17]研究发现，敲低模型鼠中Treg细胞能够导致肿瘤进展加速。本研究发现，胰腺癌患者外周血Th17细胞表达水平高于健康对照组，而Treg细胞在胰腺癌患者外周血中的表达水平低于健康对照组，差异均有统计学意义，这提示Th17细胞很可能通过发挥促癌作用，而Treg细胞发挥抑癌作用参与胰腺癌的发病。因此，积极寻找调节Th17/Treg细胞平衡的因素显得极为重要。

近年来越来越多的研究证据表明，IL-38是Th17/Treg细胞平衡的关键调控者[18]。IL-38能够抑制NF-κB和MAPKs炎症通路，进而抑制Th17细胞产生和分化[19]。此外，IL-38还能够限制巨噬细胞的功能，进而打破巨噬细胞维持Th17/Treg细胞免疫平衡的作用，参与肿瘤、炎性疾病的发生[20]。本研究中胰腺癌患者血清中IL-38表达水平与外周血Th17细胞表达水平呈负相关，与Treg细胞呈正相关，这间接提示IL-38很可能通过调节Treg/Th17细胞平衡参与胰腺癌的发生、发展。鉴于IL-38在胰腺癌中的重要地位，进一步绘制ROC曲线对胰腺癌的患病风险进行预测，发现胰腺癌患者血清中IL-38为最佳截点150.65pg/ml时，曲线下面积为0.807，在诊断方面，其敏感度为63.6%，特异性为87.1%，具有较好的敏感度和特异性。

然而，本研究还存在一定的不足，本研究没有对癌组织中IL-38的mRNA水平进行研究，将在未来的研究中进行探讨；此外本研究为前瞻性队列研究，比较了胰腺癌患者外周血中IL-38水平，没有进一步深入研究IL-38在胰腺癌发病中发挥何种作用以及发病机制。

综上所述，IL-38在胰腺癌患者血清中表达水平降低，并且表达水平与患者肿瘤分期、分化程度及是否存在淋巴结转移有关。另外，应用外周血IL-38表达水平建立的胰腺癌风险预测模型具有良好的应用价值，有望成为新的生物学指标。