组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过下调MCM2-7表达抑制神经胶质瘤细胞增殖

李慧锋，袁忠民，3，吴森斌，马莹，赵凡一，何伟文，2，梁建峰，2，伍健伟，2

（1.广州医科大学附属第二医院神经科学研究所，广东广州 510260；2.广州医科大学附属第二医院番禺院区神经外科，广东广州 511400；3.粤港澳大湾区脑科学与类脑研究中心，广东广州 510515）

神经胶质瘤（glioma）是颅内最常见的原发性肿瘤，由于其浸润性生长和放化疗耐药性，胶质瘤的复发率高，预后差，死亡率高［1-2］。因此，研究胶质瘤发生发展的分子机制及寻找新的靶向性药物，对于治疗胶质瘤和改善预后具有重要意义。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDACIs）是一类新型的抗癌药物，它能够抑制肿瘤生长、阻滞细胞周期、诱导细胞分化和凋亡［3-4］。根据化学结构的不同可分为四类：短链脂肪酸类，如NaBu 和VPA；异羟肟酸类，如TSA、SAHA 和LBH589；苯酰胺类，如MS-275 和M344；环肽类，如FK-228。其中，SAHA 已被FDA 批准用于治疗皮肤性淋巴癌，其它组蛋白去乙酰化酶抑制剂也在进行肿瘤治疗的临床试验［5］。微小染色体维持蛋白（minichromosome maintenance proteins，MCMs）是一类DNA 复制起始时发挥关键作用的解旋酶，参与每个细胞周期内的新DNA 生成［6］。MCM2、3、4、5、6 和7 在G1 期早期形成MCM2-7 六聚体加载到DNA 复制起始位点，在G1 后期形成MCM2-7 双六聚体启动S 期DNA 复制。在癌细胞中MCM2-7高表达，这使得六聚体向双六聚体转换时间较正常细胞短，加速细胞周期，促进细胞恶性增殖［7-8］。本研究利用多种HDACIs 处理神经胶质瘤细胞株U251 和H4，观察对细胞增殖、细胞周期及MCM2-7 表达的影响，探讨HDACIs 抑制胶质瘤细胞增殖的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胶质瘤细胞株U251 和H4 细胞由国家实验细胞资源共享平台提供。高糖培养基DMEM 和0.25%胰酶购自Invitrogen 公司，胎牛血清购自Gibco 公司。LBH589、M344、SAHA、TSA 和CPX 购自Selleck公司。RT-qPCR试剂购自日本Toyobo 公司。96 孔板和6 孔板购自NEST 公司。Anti-BrdU、anti-MCM2、anti-MCM7、anti-Ac-H3K9、anti-Ac-H3K27 和anti-H3购自Cell Signaling Technology。Anti-MCM3 和anti-MCM6 购自生工生物工程有限公司，Anti-MCM4、anti-MCM5 和anti-GAPDH 购自Proteintech公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胶质瘤细胞培养及药物处理方法 用体积分数10%胎牛血清、1%双抗的高糖DMEM 培养基培养U251 和H4 细胞，设置培养箱温度为37 ℃，CO2浓度为5%，每2～3 d 用胰酶消化传代1 次。取对数生长期细胞进行实验。HDACIs 储存浓度为1 000×工作浓度，溶剂为DMSO。环丙沙星盐酸盐溶于水，储存浓度为分别为0.05mmol∕L×200，0.2 mmol∕L×200，0.5 mmol∕L×200，1.0 mmol∕L×200，使用时用培养基200倍稀释。

1.2.2 MTT 法检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂对U251 和H4 细胞增殖的影响 将对数期生长U251和H4细胞用胰酶消化后接种于96孔板，每孔100µL细胞悬液，每组设6 个平行复孔。当细胞生长至融合度为50%时，分别用0.2、0.5、1.0 和2.0 µmol∕L LBH589 处理U251 和H4 细胞24 h。用0.5 µmol∕L LBH589 处理U251 和H4 细胞8、12、16 和24 h。多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（0.5 µmol∕L LBH589、1.0µmol∕L M344 和1.0µmol∕L SAHA）处理24 h，对照组加入等量溶剂DMSO，MTT 法检测细胞存活率，方法同上。处理结束后每孔加入10µL MTT 溶液（5 g∕L）继续培养4 h后终止培养，弃培养液，每孔加入100µL二甲基亚砜（DMSO），摇床振荡10min，用酶标仪检测490 nm 波长下各孔的吸光度值［9］。

1.2.3 BrdU 掺入试验检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂对U251 细胞DNA 复制的影响 6 孔板U251细胞密度达到60%至70%时，分别用0.5µmol∕L LBH589、0.5µmol∕L TSA 处理U251 细胞，对照组加入等量溶剂，24 h 后向培养基中加入终浓度为10µmol∕L 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo deoxyuridine，BrdU），培养箱孵育4 h，40 g∕L 多聚甲醛室温固定30min，用PBS洗3遍后加入2mol∕L的盐酸（溶于0.1%Tween-20 的PBS）37 ℃孵育30 min，正常山羊血清封闭1 h，加入BrdU 一抗（1：100），4 ℃过夜，再用PBS洗3次，加入Cy3标记的二抗室温孵育1 h。洗3 遍后，用Hochest33258 室温染核10 min，免疫荧光显微镜观察并拍照［10-11］。

1.2.4 流式细胞仪检测多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂对U251 和H4 细胞周期的影响 用多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（0.5 µmol∕L LBH589、1.0µmol∕L M344 和1.0µmol∕L SAHA）处理U251和H4细胞12h后，使用PBS洗一遍，胰酶消化吹散后收集于1.5mL EP管，离心（4 ℃，644×g，5 min，r=9.5 cm）后弃上清，加入1 mL PBS 洗两遍，4 ℃，644×g，r=9.5 cm，离心5 min。加入75%溶于PBS的乙醇500 µL，于-20 ℃冰箱过夜后离心弃上清，PBS 洗两遍，加入500µL 溶于PBS 终浓度为50µg∕mL 的碘化丙啶（Propidium iodide，PI）于室温避光染色30 min，使用流式细胞仪检测细胞周期［12］。

1.2.5 RT-qPCR 法检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂对U251 和H4 细胞MCM2-7 mRNA 表达的影响用多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（0.5 µmol∕L LBH589、1.0 µmol∕L M344 和1.0 µmol∕L SAHA）处理U251和H4细胞12 h后，用Trizol法提取总RNA，RT-qPCR 分别检测MCM2-7 的表达。引物序列见表1。

表1 MCM2-7及GAPDH引物序列Table 1 Primers of MCM2-7 and GAPDH

1.2.6 Western blotting 检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂对U251和H4细胞MCM2-7蛋白表达的影响组蛋白去乙酰化酶抑制剂（0.5 µmol∕L LBH589、1.0 µmol∕L M344 和1.0 µmol∕L SAHA）处理U251和H4细胞12 h后，每孔加入2 mL冰PBS洗两遍后，用加入蛋白酶抑制剂的IP buffer 收集细胞，BCA 法测定蛋白浓度并配平。灌制4%集成胶和10%分离胶，200 V 电压电泳45 min，100 V 电压转膜100 min，50 g∕L 脱脂奶粉室温封闭1 h。分别加入一抗（Anti-MCM2-7、anti-AcH3K9、anti-AcH3K27、anti-H3 1：1 000 和 anti-GAPDH 1：10 000）4 ℃孵育过夜，回收一抗后再分别加入HRP标记抗兔或抗鼠二抗室温孵育1 h，ECL 发光后曝光。

1.2.7 MTT 法检测CPX 对U251 和H4 细胞增殖的影响 分别用不同浓度CPX（0.05、0.2、0.5 和1.0 mmol∕L）处理U251 和H4 细胞24 h，0.5 mmol∕L CPX处理U251 和H4 细胞不同时间（8、12、16 和24 h），MTT法检测相对细胞数，方法同上。

1.2.8 流式细胞术检测CPX 对细胞株U251 和H4细胞周期的影响 用0.5 mmol∕L 的环丙沙星处理U251 或H4 细胞12 h 后，流式细胞仪检测细胞周期，方法同上。

1.3 统计学方法

使用SPSS 25.0 统计软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示。3 组及以上样本的均数比较采用单因素方差分析，随后的组间比较如符合方差齐性采用LSD 法，否则采用Dunnett-t3 检验。P＜0.05 被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HDACIs 对U251和H4细胞增殖的影响

2.1.1 不同浓度LBH589对U251及H4细胞增殖的影响 分别用0.2、0.5、1.0 和2.0µmol∕L LBH589 处理U251及H4细胞24 h后，MTT 法测定吸光度值后统计分析每组相对细胞数。差异具有统计学意义（U251：F=229.200，P=0.000，H4：F=32.328，P=0.000，图1A）。采用LSD 法进一步作两两比较，与对照组相比差异均具有统计学意义（P＜0.05），LBH589 浓度0.2 µmol∕L 与0.5 µmol∕L 组差异具有统计学意义（P＜0.05），LBH589 浓度为0.5 µmol∕L达到半数抑制浓度后随浓度增加相对细胞数差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

2.1.2 0.5µmol∕LLBH589作用不同时间对U251和H4细胞增殖的影响分别用0.5µmol∕L LBH589 处理U251 和H4 细胞8、12、16 和24 h，相对细胞数差异具有统计学意义（U251：F=67.211，P=0.000，H4：F=53.195，P=0.000；图1B）。采用LSD 法进一步两两比较，除了U251 细胞8 h 组与对照组相比无统计学意义（P＞0.05）外，其他处理与对照组相比，相对细胞数均减少（P＜0.05）。随着处理时间的延长，相对细胞数越少（P＜0.05）。

2.1.3 不同种类组蛋白去乙酰化酶抑制剂对U251和H4细胞增殖的影响分别用0.5µmol∕LLBH589、1.0µmol∕L M344 和1.0µmol∕L SAHA 处理U251 和H4 细胞24 h 后，MTT 法测定吸光度后统计相对细胞数，差异具有统计学意义（U251：F=26.600，P=0.000，H4：F=55.461，P=0.001；图1C 和D）。采用LSD 法进一步统计分析，与对照组相比，相对细胞数均减少（P＜0.05）。

图1 HDACIs抑制神经胶质瘤细胞增殖Fig.1 HDACIs suppresses the proliferation of glioma cells

2.2 HDACIs抑制U251细胞的DNA合成

用0.5 µmol∕L LBH589、0.5 µmol∕L TSA处理U251 细胞24 h 后，加入BrdU 继续孵育4 h 后检测细胞增殖率。与对照组比较，BrdU 的掺入率降低，差异具有统计学意义（F=161.628，P=0.000；图2）。采用LSD 法进一步作两两比较，与对照组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

图2 HDACIs抑制U251细胞DNA合成Fig.2 HDACIs suppresses DNA synthesis of U251 cells

2.3 HDACIs阻滞U251和H4细胞周期

分别用0.5 µmol∕L LBH589、1.0 µmol∕L M344和1.0µmol∕L SAHA处理U251和H4细胞12 h后，流式细胞仪检测细胞周期，细胞周期的S 期的比例差异具有统计学意义（U251：F=4.478，P＜0.05；H4：F=3.821，P＜0.05；图3）。采用LSD法进一步两两分析，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图3 HDACIs减少U251和H4细胞周期的S期在整个细胞周期比率Fig.3 HDACIs reduce the S-phase of U251 cell cycle

2.4 HDACIs下调U251 和H4 细胞内MCM2-7 mRNA水平

分别用0.5 µmol∕L LBH589、1.0 µmol∕L M344和1.0 µmol∕L SAHA 处理U251 和H4 细胞12 h 后，RT-qPCR 检测MCM2-7 mRNA 的表达。与对照组相比，MCM2-7 的表达均减少，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

HDACIs 处理U251（图4A）和H4（图4B）细胞株MCM2-7 的统计结果分别为：MCM2（U251：F=1036.480，P=0.000，H4：F=77.715，P=0.000）；MCM3（U251：F=158.980，P=0.000，H4：F=381.592，P=0.000）；MCM4（U251：F=657.406，P=0.000，H4：F=83.059，P=0.000）；MCM5（U251：F=803.059，P=0.000，H4：F=382.211，P=0.000）；MCM6（U251：F=352.036，P=0.000，H4：F=88.841，P=0.000）；MCM7（U251：F=49.167，P=0.000，H4：F=325.376，P=0.000）。

图4 HDACIs下调MCM2-7 mRNA水平Fig.4 HDACIs inhibit MCM2-7 mRNA expression

2.5 HDACIs减少U251 和H4细胞MCM2-7 蛋白表达

为了探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂是否也抑制胶质瘤细胞MCM2-7蛋白的表达，用多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（包括0.5 µmol∕L LBH589、1.0µmol∕L M344 和1.0 µmol∕L SAHA）处理U251 和H4细胞12 h 后，Western blotting 结果显示，与对照组相比，MCM2-7 蛋白表达均减少，差异具有统计学意义（P＜0.05；图5）。

图5 HDACIs减少U251和H4细胞MCM2-7 蛋白表达Fig.5 HDACIs inhibit MCM2-7 protein expression

U251 和H4 细胞株MCM2-7 蛋白表达的统计结果分别为：MCM2（U251：F=19.770，P=0.000，H4：F=61.786，P=0.000）；MCM3（U251：F=21.068，P=0.000，H4：F=211.440，P=0.000）；MCM4（U251：F=162.830，P=0.000，H4：F=55.091，P=0.000）；MCM5（U251：F=24.646，P=0.000，H4：F=1 132.800，P=0.000）；MCM6（U251：F=41.849，P=0.000，H4：F=103.920，P=0.000）；MCM7（U251：F=52.731，P=0.000，H4：F=113.600，P=0.000）。

Ac-H3K9（U251：F=29.615，P=0.000，H4：F=358.502，P=0.000）；Ac-H3K27（U251：F=370.974，P=0.000，H4：F=13.960，P=0.002）。

2.6 环丙沙星抑制MCM2-7 活性对U251 和H4细胞增殖的影响

2.6.1 不同浓度环丙沙星对U251 和H4 细胞增殖的影响 环丙沙星（CPX）是解旋酶MCM2-7 活性抑制剂，为了确定抑制MCM2-7 后U251 细胞的增殖率是否降低，MTT 法检测向U251和H4细胞后加入0.05、0.2、0.5和1.0 mmol∕L CPX 24 h后，各组相对细胞数差异具有统计学意义（U251：F=65.099，P=0.000，H4：F=287.348，P=0.000；图6A），进一步对U251 和H4细胞采用LSD法两两比较，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），随着浓度的增大，细胞增殖率逐渐减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.6.2 环丙沙星作用不同时间对U251和H4细胞增殖的影响 用0.5 mmol∕L 的环丙沙星分别作用U251 和H4 细胞8、12、16 和24 h 后，MTT 法检测细胞相对数，差异具有统计学意义（U251：F=152.488，P=0.000，H4：F=187.348，P=0.000；图6B）。

图6 环丙沙星抑制胶质瘤细胞U251和H4增殖Fig.6 CPX suppresses the proliferation of glioma cells

2.7 环丙沙星阻滞U251和H4细胞周期

为了确定抑制MCM2-7后U251和H4细胞周期是否改变，流式细胞术检测发现加入0.5 mmol∕L CPX 12 h 后，与对照组相比，U251 和H4 细胞周期S 期均显著减少，差异具有统计学意义（U251：t=5.306，P=0.000，H4：t=2.306，P=0.000；图7）。

图7 环丙沙星减少U251和H4细胞周期的S期Fig.7 CPX reduces the S-phase of U251 and H4 cells cell cycle

3 讨论

由于局部侵袭性强且缺少针对性治愈方法，胶质瘤是目前最具致命性的癌症之一。尽管手术切除和放化疗手段在不断提高，胶质瘤生存率仍未得到改善［13-14］。分子生物学的发展提高了对胶质瘤发病机制的认识，完善了胶质瘤的诊断、分级和治疗手段。恶性胶质瘤伴随DNA 复制能力增强的特点，DNA 复制调控蛋白MCM2-7 的表达与肿瘤的WHO分级密切相关［15-16］。

乙酰化和去乙酰化的动态平衡调节着基本的生理功能如细胞存活、死亡、周期等，而乙酰化失衡引起的基因表达异常会导致上述功能紊乱，继而造成多种疾病的发生［17-18］。特别是，HDACs活性增强介导的去乙酰化事件已被证明是胶质瘤等多种肿瘤发生、发展的重要病理原因［19］。在这种微环境条件下，一系列抑癌基因如p21、p16、Rb 的表达下调，而原癌基因如Raf1、EGFR、c-Jun 高表达，促进癌症发生［20-21］。我们发现HDACs 活性介导了MCM2-7 表达，增强了DNA 复制能力，这可能是肿瘤细胞适应恶性增殖的一种特征。HDACs 的底物包括组蛋白和非组蛋白，它们一方面通过去乙酰化核小体上组蛋白H3、H4、H2A 和H2B，使染色体结构重塑以调控基因转录［22］。另一方面，还通过改变转录因子乙酰化状态，影响其活性，调控基因表达［23］。但HDACs通过何种机制调控MCM2-7表达，尚需进一步研究。

总之，本研究阐明了HDACIs 抑制MCM2-7 表达和DNA 复制起始进程是其重要抗癌机制之一。另一方面，这些研究结果还表明在胶质瘤细胞内MCM2-7 的表达依赖HDACs 活性，高活性的HDACs 促进MCM2-7 表达以增强DNA 复制能力，适应恶性增殖。我们的研究不仅揭示了HDACIs的抗癌新机制，还首次报道了MCM2-7 表达依赖HDACs 活性，为认知胶质瘤的发生本质和靶向治疗提供了新的理论和实验依据。