饲粮纤维水平对苏禽3号肉种鸡血清免疫指标、盲肠结构及生长相关基因表达的影响

黄正洋，王钱保，李春苗，黄华云，穆春宇，黎寿丰，赵振华

(中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州 225125)

饲粮纤维是畜禽饲料中普遍存在的功能组分，主要构成为纤维素。纤维素是一种天然存在的生物大分子多糖，根据其溶解度差异，可分为不溶和可溶2种。饲粮纤维主要是不可溶纤维素，它在家禽生产中均有重要的营养价值及生理功能。一方面家禽自身可少量吸收部分饲粮纤维，为家禽生产提供营养物质；另一方面饲粮中加入粗纤维，由于粗纤维的结构特点，家禽摄入之后可维持肠道正常的结构和功能，避免发生肠道疾病，提高家禽的抗病性。目前，对饲粮纤维的研究，主要是集中在家禽对饲粮纤维的消化吸收方面。饲粮纤维对家禽免疫性能的影响研究还不够系统。在哺乳动物中饲粮纤维对机体免疫性能的影响，主要是通过改善肠道微生物区系，进而提高抗病力和免疫力。在鸡中是否也有相同的功能，尚需进一步研究。笔者所在课题组前期对生长性能统计分析发现，4%饲粮纤维可显著提高试验组家禽生长性能，降低死亡率，说明饲粮纤维对家禽的促生长作用是确定的。相关研究内容已被录用。

本试验研究不同纤维水平饲粮对苏禽3号肉种鸡血清免疫指标、盲肠生理结构变化及生长相关基因表达的影响，旨在探索家禽饲粮中不同比例纤维添加，对肉种鸡免疫及生长的影响，为生产中低玉米豆粕饲粮开发提供试验支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

本试验于2020年8—10月在中国农业科学院家禽科学研究所邵伯试验基地进行，以中国农业科学院家禽科学研究所选育的苏禽3号肉种鸡为试验对象。试验选取体质量约1.2 kg，10周龄苏禽3号母鸡360羽，采用单因素完全随机试验设计，随机分成3组，每组4个重复，每个重复30羽鸡。产蛋鸡舍3层阶梯笼内饲养(每笼1羽)，整个试验期间，所有鸡仅自由饮水，常规光照和免疫，试验期间为11～21周龄。按对照组饲喂纤维含量2%基础日粮(简称2%组)，试验1组饲喂纤维含量4%试验饲粮(简称4%组)，试验2组饲喂纤维含量6%试验饲粮(简称6%组)。

1.2 试验饲粮

试验饲粮由江苏盐城源耀饲料有限公司按照试验要求配制，其组成及营养水平见表1。其中，苜蓿原料由宁波聚信瑞宏进出口有限公司进口，自西班牙苜蓿草颗粒(紫花苜蓿，初花期刈割，250～300 ℃ 热空气中处理，快速将苜蓿的湿度降至 8%～12%。再经研磨、造粒、冷却3个步骤，形成 5～10 mm颗粒)。该苜蓿草颗粒的各营养成分为干基蛋白≥16.0%，灰分≤12.0%，粗纤维28.0%，水分11.0%。

表1 饲粮组成及营养水平

1.3 血清免疫指标的测定

鸡饲养至21周龄时，每组随机选取30羽采集血样，分离血清，置于-20 ℃中保存。采用鸡卵黄免疫球蛋白Y(immunoglobulin Y，IgY)ELISA检测试剂盒、鸡白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)ELISA检测试剂盒、鸡白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA检测试剂盒、鸡肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-)ELISA检测试剂盒、鸡干扰素(tumor necrosis factor，IFN-)ELISA检测试剂盒进行血清中IgY、IL-2、IL-6、TNF-和TNF-等免疫指标的测定，试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。各个指标具体测定操作步骤参照试剂盒说明书。

1.4 盲肠结构分析

分离各组试验鸡肠道组织，采取盲肠中段约 1 cm，放入10%中性福尔马林溶液中固定24 h后，换固定液修整样品继续固定备用。所有肠道样品经处理，采用莱卡切片机沿肠管长轴垂直方向切片，每肠段切3片，HE染色，中性树胶封片观察。采用Image-ProPlus 5.0图像分析软件系统测量盲肠的绒毛高度、隐窝深度，并计算绒毛高度/隐窝深度的比值。绒毛高度以绒毛顶端至绒毛基部为准；隐窝深度为肠腺底部至两绒毛之间基部开口处的距离。选取多点后取平均值，然后进行整理及统计分析。

1.5 总RNA抽提与cDNA合成

采用动物组织总RNA提取试剂盒提取各个组织总RNA，加入DNase Ⅰ去除可能存在的基因组DNA，采用NanoDrop浓度仪测定RNA浓度，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，确定总RNA完整度且纯度符合试验要求后，方可进行下一步试验。取2 μg总RNA，根据Quant cDNA第1链合成试剂盒以Oligo dT为引物合成cDNA第1链。动物组织总RNA提取试剂盒、Quant cDNA第1链合成试剂盒、Talent荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)，均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.6 引物设计与合成

根据GenBank数据库中鸡肌肉生长抑制素基因(基因)、成肌分化抗原1()基因、配对盒7()基因和生长激素()基因序列，利用Primer 6.0和Oligo 7.0设计qRT-PCR引物，以基因为内参基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，相关引物信息见表2。

表2 试验中使用到的RT-qPCR引物

1.7 基因组织表达分析

采用Trizol Reagent提取卵巢、心脏、肝脏和胸肌组织总RNA，加入DNA酶去除基因组DNA，NanoDrop浓度仪测定其浓度，琼脂糖凝胶电泳检测完整性，待分析表明符合要求后，可进行下一步试验。取2 μg总RNA，根据反转录试剂盒说明以Oligo dT为引物合成cDNA第1链。

分别对基因、基因、基因和基因序列进行组织表达分析。qRT-PCR扩增体系和程序参照定量试剂盒推荐。PCR反应在Applied Biosystems 7 500荧光定量PCR系统中进行，作为内参，每个样本重复3次，采用2-ΔΔ计算mRNA相对表达量。

1.8 统计与分析

数据分析采用IBM SPSS 26一般线性模型GLM过程的one-way ANOVA进行单因素方差分析，以<0.05作为差异显著，<0.01作为差异极显著。试验结果采用“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 饲粮纤维水平对苏禽3号对血清免疫指标的影响

由表3可知，饲粮中添加纤维对苏禽3号肉种鸡血清免疫指标的影响。随着饲粮纤维水平升高，IgY、IL-2和TNF-含量均呈现出先下降后上升的趋势，4%组血清中IgY、IL-2和TNF-含量显著低于对照组(2%组)和6%组(<0.05)；IL-6和TNF-含量呈现相反的变化趋势，6%组血清中IL-6和TNF-含量显著低于4%组(<0.05)。

表3 饲粮纤维水平对苏禽3号血清免疫指标的影响

2.2 饲粮纤维水平对苏禽3号盲肠结构的影响

由图1可知，添加饲粮纤维水平可改善苏禽3号的盲肠肠道结构形态，绒毛形态更加完整，边界更加清晰，绒毛完整度更高，切片碎片较少。由表4可知，随着饲粮纤维水平的提高，盲肠绒毛高度先下降后增加，隐窝深度变浅，绒毛高度/隐窝深度比值呈现显著上升趋势(<0.05)，6%组比值最大。

表4 饲粮纤维水平对苏禽3号盲肠结构的影响

2.3 饲粮纤维水平对苏禽3号生长相关基因表达的影响

饲粮纤维水平对苏禽3号生长相关基因表达的影响结果，由图2可知，随着饲粮中纤维水平的提高，与对照组相比，4%组和6%组中基因、基因和基因在肝脏和胸肌中表达量均较高。随着饲粮纤维水平的上升，基因表达量在胸肌组织中显著高于对照组(<0.05)，在肝脏组织中，4%组显著高于对照组和6%组(<0.05)，在卵巢和心脏中没有明显差异(>0.05)。在肝脏组织中，基因在4%组表达水平最高，其他组织变化没有达到显著水平(>0.05)，基因和基因变化趋势相似。基因在胸肌中4%组和6%组表达量显著升高(<0.05)，且在卵巢中4%组表达量显著高于其他组别(<0.05)。

3 讨论

3.1 饲粮纤维水平对苏禽3号血清免疫指标的影响

畜禽血清中抗体水平高低是评估其免疫状况的重要指标之一，在现有研究中，主要通过检测相关免疫指标变化，来评价某些添加剂对家禽免疫性能的影响。杨仕柳等通过在饲粮中添加不同比例的壳聚糖饲用微生物制剂来饲喂湘黄鸡，发现饲粮中添加壳聚糖可促进免疫器官发育，提高了试验鸡群的抗病力。李海燕等研究发现，在饲料中添加0.8%桦褐孔菌发酵产物，能促进鸡生产和免疫性能。郭晓秋等以河南固始鸡为试验素材，添加不同剂量女贞子水煎剂，发现添加0.1%、0.2%女贞子水煎剂可显著提高固始鸡新城疫抗体效价。张慧辉通过提取紫花苜蓿中的水溶性苜蓿多糖，以不同途径饲喂试验动物，结果发现水溶性苜蓿多糖显著促进了免役器官发育，提高了T淋巴细胞转化率，提示不同类型的饲料纤维，均可提高试验对象的免疫性能表现。本研究通过添加纤维，探讨对苏禽3号肉种鸡血清生免疫指标的影响，发现随着饲粮纤维水平的升高，IgY、IL-2和 TNF-均呈现先下降后上升趋势，4%组的血清中IgY、IL-2和TNF-含量显著低于对照组和试验2组(<0.05)，提示饲粮中添加纤维后，促进了苏禽3号免疫性能提升，但是纤维水平继续提高至6%，相应指标反而下降，提示太高的纤维水平不利于试验鸡免疫性状的持续改善，其原因可能是过高的纤维水平，使得饲粮营养含量迅速降低，动物摄入营养的效率大大降低，从而使得免疫性状下降。

3.2 饲粮纤维水平对苏禽3号盲肠结构的影响

盲肠是家禽大肠的重要组成部分，具有多种生理功能。它不仅能够吸收营养、调节渗透压、合成维生素，还能够承担细菌发酵、机体有益细菌库和辅助免疫反应。盲肠的重要生理功能，在不同动物上均有研究。周金星等研究不同剂量的党参、淫羊藿提取物对青脚麻鸡盲肠组织结构的影响，发现二者的提取物可增强青脚麻鸡盲肠黏膜的正常免疫屏障结构。杨建平等研究了饲料中添加复合植物精油对58周龄海兰褐蛋鸡肠道菌群的影响，结果发现添加复合植物精油提高了盲肠拟杆菌门的相对丰度，改善了肠道菌群结构。任敏敏等研究了不同纤维水平对金华猪盲肠菌群结构的影响，结果发现提高纤维水平可提高盲肠中拟杆菌目S24-7菌属等细菌的相对丰度，改善平均日增重。纤维水平地升高，对于家禽来说，属于一种外来刺激，会诱导肠道特别是家禽细菌库盲肠内相关纤维分解菌数量增加。本研究也发现，一定比例的纤维素，会刺激肠道做出反应，有利于机体免疫性能的增强，但是当纤维素比例过高，反而会导致机体肠道黏膜受损，绒毛形态变化，免疫性能下降。在本研究中，添加4%饲粮纤维水平，观察到盲肠的肠道结构形态改善，绒毛形态更加完整。随着饲粮纤维水平地提高，盲肠绒毛高度先下降后增加，隐窝深度变浅，绒毛高度/隐窝深度比值呈现上升趋势，4%组和6%组的比值显著高于对照组。

3.3 饲粮纤维水平对苏禽3号生长相关基因表达的影响

家禽生产主要是获取对人类有用的肉、蛋等物质，肌肉生长对家禽生产至关重要。目前，影响家禽生长的基因很多，此方面研究也很多。毛亮等对藏鸡基因进行克隆，并对其组织表达变化进行分析发现，在腿肌、胸肌、心脏、肾脏、睾丸、卵巢和胃中均检测到基因表达，脂肪、肝脏和肺中未检测到。张冉等对济宁百日鸡、莱芜黑鸡和汶上芦花鸡基因表达进行检测，结果发现不同品种及不同发育阶段表达变化间存在差异。本研究发现，基因在胸肌、卵巢、心脏及肝脏中均有表达，并且在胸肌中表达最高，且随着饲粮中纤维水平地提高，表达水平也随之提高，4%组和6%组显著高于2%组(对照组)。基因是目前研究最多的畜禽生长相关基因，已明确了其具有促进畜禽生长的作用。何琦等检测了不同胫长性状鸡种中的基因表达变化，发现了在同一品种中，腿肌组织中表达量最高，本研究中虽然没有检测腿肌组织，但是检测了同为骨骼肌的胸肌组织，发现基因在本研究检测的组织中表达量也是最高。基因是生肌调节因子家族重要的成员之一，它对骨骼肌的发生、分化和成熟起着决定性的作用。张久盘等对固原鸡个体发育过程中基因组织表达变化进行分析，结果发现基因在肌肉组织中表达量极显著高于其他组织，并且在胸肌中的表达量高于腿肌中。但在本研究中发现，在肝脏组织中基因有较高的表达量，在胸肌中表达量仅达其他组织的平均水平，这可能与试验品种和试验条件相关。基因是调控骨骼肌卫星细胞增殖和分化的重要的转录因子。张锁检测了基因不同发育阶段的表达规律，结果发现，该基因在不同组织各个发育阶段广泛表达，且在各常见组织如心脏、肝脏、胸肌和小肠等中表达量均较高。本研究也发现，基因在肝脏、胸肌和心脏等组织中表达量均较高，生长相关基因在肌肉组织中均有较高表达。

4 结论

在本试验条件下，饲粮纤维水平由2%提高至4%，可提高苏禽3号免疫性能，增强盲肠绒毛形态完整，促进生长相关基因，如基因、基因、基因和基因的表达；饲粮纤维水平提高至6%，免疫性能与对照组相比差异不大。