化肥减量配施生物炭对镉污染水稻土壤真菌群落的影响

丁 玮，阳树英，刘 洋

(湖南农业大学资源环境学院，湖南长沙 410128)

镉是一种生物毒性极强的重金属元素，近年来，农田土壤镉污染的情况日趋严重，已成为我国土壤的首要污染物之一。水稻作为我国重要的粮食作物，同时也是喜镉作物，极易从土壤中吸收累积镉进而通过食物链进入人体造成极大危害。同时我国农田土壤还存在大量施用化肥导致施用量过高但利用率低等问题。生物炭是一种具有较高表面积、孔隙度、吸附性以及高稳定性的富含碳材料，研究发现，施用生物炭能够起到促进农作物生长的作用，同时也具有改善土壤结构以及理化性质的效果，并且可以使得土壤中重金属的生物有效性下降，还能够有效降低水稻稻米对镉的吸收量。

土壤微生物参与土壤生态过程，在生态系统物质循环和能量流动中起关键作用，能通过群落组成和结构变化较敏感地反映土壤条件的改变。反之，土壤的形态、理化性质等因素也会对微生物的群落产生影响。生物炭本身具有的特性对水肥具有良好的吸收保持能力，这也为微生物的生存提供了适宜良好的环境。王彩云等研究表明，10年连作土壤施入生物炭可显著提高土壤微生物活性、Shannon指数和均匀度指数，同时显著提高了土壤微生物对糖类、氨基酸类、酚酸类和胺类碳源的利用强度。众多试验结果表明，施加生物炭可以增加土壤中细菌、真菌和放线菌的数量。殷全玉等在烟地中连续4年进行生物炭施加处理，结果显示生物炭的连续施加能够对土壤真菌的群落结构起显著性改善作用，但OTU数量及α多样性指数未发生显著性差异。李茂森等在植烟土壤中施加生物炭后，提高了毛霉门和担子菌门的相对丰度，降低了子囊菌门的相对丰度。王义祥等研究在酸化茶园土壤中施加生物炭5年后，土壤pH值、可溶性有机碳含量、铵态氮和硝态氮含量都得到了提高，Chao指数、ACE指数和Shannon指数随生物炭用量的增加呈先增加后降低的趋势，被孢霉属、木霉属、毛壳菌属的相对丰度增加，黑盘孢属的相对丰度降低。杨文娜等研究化肥和有机肥配施生物炭对土壤磷酸酶活性和微生物群落的影响，结果表明，化肥和有机肥配施生物炭可增加果园植株根际土壤的酶活性以及根际和非根际土壤中和基因的多样性。在化肥配施生物炭处理的研究中，杨浩鹏等研究表明，生物炭配施化肥处理不仅可以缓解化肥单独使用带来的负面效果，同时可达到肥料肥力合理释放，化肥减量增效的效果。

已有研究证实，生物炭因自身具有多孔径结构以及自身强大的吸附力，使镉转化为沉淀，减少了土壤中镉的影响。另外，生物炭增加了土壤pH值，意味着土壤中镉的活性也会降低。生物炭配施化肥能够进一步有效地对土壤中的重金属起到钝化作用，并促进作物生长。但目前关于生物炭及化肥减量配施生物炭对镉污染土壤的研究较少，尤其是对其土壤真菌群落结构影响的研究鲜见报道。因此，本研究设计一年期大田试验，采用单施生物炭以及化肥减量配施生物炭等不同处理，采用高通量测序技术，以期明确不同处理对于土壤理化指标以及土壤真菌群落结构的影响，为单施生物炭以及化肥减量配施生物炭修复镉污染土壤以及水稻安全生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验地概况

于2019年在湖南省浏阳市永安镇甘家屋农技站一块镉污染农田土壤上进行一年期试验，该地地处113°17′E，28°15′N，永安镇全年平均气温为 17.3 ℃，全年平均降水量为1 171.6 mm，水稻田土壤为潮泥土，土壤pH值为5.62，土壤初始镉含量为0.53 mg/kg。水稻品种采用湘早籼45，供试生物炭采用稻壳生物炭，制备方式是将稻壳在500 ℃下进行高温热解4 h，生物炭基本化学性状：pH值为10.4，含碳量为512 g/kg，含氮量为7.8 g/kg，其他元素合计为480 g/kg，容重为 0.16 g/cm。

1.2 试验设计

试验设计6个不同处理，分别为空白对照组(CK)，单施生物炭T1处理(30 t/hm)、T2处理(60 t/hm)，单施化肥处理(CKJ)、化肥减量配施生物炭T1J处理(生物炭30 t/hm)、T2J处理(生物炭60 t/hm)，不同处理重复3次。生物炭及化肥的具体施用量见表1，随机区组设计，每小区42 m(6 m×7 m)。在水稻移栽前，一次性通过人工翻耕处理施入不同生物炭量。施肥前田间各小区田埂提前均采用耐用的黑色塑料薄膜将土壤进行覆盖包裹处理，目的是为了防止不同处理之间发生窜肥窜水的情况，试验地其他农作管理制度和措施均遵守当地常规管理制度。

表1 不同处理生物炭与肥料施用量

利用工具取土钻在水稻收割前收集0～15 cm土层样品，5点土样法取样后迅速混匀，取其中部分采用聚乙烯自封袋分装，放入冰盒，委托诺禾致源生物科技有限公司进行ITS1高通量测序；剩余的部分土样风干后进行过筛处理留存，用于检测土壤理化性状。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤真菌总DNA的提取 土壤真菌总DNA的提取，采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法进行，再采用琼脂糖凝胶电泳方法检测提取后的DNA样品的完整性，以无菌水稀释浓度至 1 ng/μL。

1.3.2 真菌高通量测序 PCR扩增是将稀释后的基因组DNA作为模板，引物采用的是ITS1区带有Barcode的特异性引物。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒(赛默飞世尔科技公司)对PCR产物进行文库的构建，通过Qubit定量检测，结果合格后采用Ion S5TMXL(赛默飞世尔科技公司)上机测序。

1.3.3 土壤理化性状测定 土壤pH值采用pH计PHS-3E型(上海雷磁)测定；土壤有机质含量采用重铬酸钾容量法测定；土壤碳、氮含量的测定使用元素分析仪(德国Elementar)；土壤镉、镁、钾消解后采用电感耦合等离子发射光谱仪(ICAP7200)测量含量。

1.4 数据处理

以97%的一致性聚类OTU后进行物种注释，使用Qiime软件对土壤微生物多样性进行计算，并将结果进行α多样性分析；采用IBM SPSS 21.0进行方差分析和相关性分析；采用R语言分析对土壤理化性质以及土壤优势真菌门群落间进行冗余分析；采用Duncan’s检验进行多重差异显著分析。

2 结果与分析

2.1 测序数据分析

通过高通量测序，经过质控平均得到75 519条有效数据，从图1可以看出，6个不同处理的样品随序列量的增加，OTU数目在快速上升后逐渐趋向于平坦，说明虽然存在有小部分低丰度类群未被覆盖的情况，但是此结果已涵盖绝大部分物种信息。从表2可以看出，不同处理条件下的样品覆盖率结果显示均在98.90%以上，表明数据结果能够对样本土壤真菌群落组成达到基本反映。

对土壤样品进行α多样性分析，结果(表2)表明，T1、T2、T1J处理较对照降低了Simpson指数，但差异不显著。生物炭配施化肥T2J处理较对照处理提高了Shannon指数，但差异不显著。Chao1指数、ACE指数在处理后无显著性差异，表明生物炭及配施化肥未显著改变土壤真菌群落多样性及丰富度。

表2 不同处理土壤样品真菌群落多样性指数分析

2.2 真菌群落结构分析

门水平上不同处理真菌的相对丰度见图2，排名前10的菌门分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、Aphelidiomycota、Kickxellomycota、单毛壶菌门(Monoblepharomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、罗兹菌门(Rozellomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)。真菌的优势菌门(相对丰度>5%)为子囊菌门、担子菌门。对生物炭及配施化肥处理后的菌门相对丰度变化进行分析，担子菌门的相对丰度在4.1%～28.4%，担子菌门的相对丰度在生物炭处理及配施化肥处理后呈上升趋势，其中T1J处理较对照组处理相对丰度显著上升(<0.05)。壶菌门的相对丰度为0.5%～18.5%，T2处理显著高于CK处理。

2.3 土壤真菌菌落与土壤理化性质的关系

2.3.1 土壤理化性质分析 不同处理土壤理化性质见表3，单施生物炭T1、T2处理以及化肥减量配施生物炭T1J、T2J处理较对照组土壤pH值均显著提高，且随着生物炭施加量升高而增加，CKJ处理较对照组土壤pH值显著降低值。T2J处理较对照组土壤有机质含量显著提高，T2处理显著提高了土壤碳氮比。T2J处理较对照组全氮含量显著提高；土壤全氮含量表现为随着生物炭施加量的提高而逐渐上升，化肥减量配施生物炭T1J、T2J处理较单施生物炭T1、T2处理全氮含量提高但差异不显著。土壤全钾、全镁含量在生物炭T1、T2处理后显著性下降，化肥减量配施生物炭T1J、T2J处理较单施生物炭T1、T2处理全钾含量升高。土壤镉含量在生物炭处理后随着生物炭施加量的增大而下降，化肥减量配施生物炭T1J、T2J处理较单施生物炭T1、T2处理镉含量下降。

表3 不同处理土壤理化性质

2.3.2 生物炭及化肥配施处理条件下的土壤真菌群落与土壤理化性质的冗余分析 通过对不同处理土壤真菌群落结构与土壤理化性质进行冗余分析，分析结果见图3，2个主要轴特征值分别为50.61%和26.43%，可以对77.04%的真菌群落变化进行解释。土壤全氮含量、有机质含量与RDA1轴呈正相关，土壤全镁、镉含量与RDA1轴呈负相关，土壤碳氮比、pH值与RDA2轴呈正相关，土壤全钾含量与RDA2轴呈负相关。T2处理与CK处理距离最大，说明生物炭T2处理改变了土壤真菌群落结构。土壤pH值、全氮含量及土壤碳氮比对真菌群落结构具有显著影响。

2.3.3 不同处理土壤真菌主要菌群与土壤理化性质的Pearson相关分析 将土壤理化因子与主要真菌群落之间进行Pearson相关分析，从表4可以看出，其中主要真菌门共10个，其中显示有5个真菌门的变化与土壤理化性质呈现出显著性相关。其中，土壤pH值与壶菌门呈显著正相关；土壤有机质含量与球囊菌门呈显著正相关；土壤全氮含量与子囊菌门呈显著正相关；土壤碳氮比与壶菌门呈显著正相关，与被孢菌门、芽枝霉门呈极显著正相关。

表4 真菌菌落与土壤理化性状的Pearson相关分析结果

3 讨论与结论

土壤微生物是土壤各项生态功能的重要参与者，土壤微生物的丰度以及多样性能够对土壤环境的改变产生灵敏的反映，而土壤真菌是有机物质分解和土壤生物量的主要组成部分，在农业生态系统中十分重要。生物炭配施化肥处理能够提供更加充足的养分，对土壤C/N进行调节，能更大程度地提高有机物质的利用效率，激发土壤微生物的活性和增加有益菌数量，同时生物炭的碳骨架有较好的持水性和通气性，能够使得微生物的繁衍拥有更好的生存环境。本试验结果表明，单施生物炭处理时，镉污染土壤的多样性及丰富度无显著性改变，本结果与李茂森等的研究结果一致，而生物炭配施化肥处理较对照组虽然提高了土壤真菌群落多样性，但差异不显著。这种结果出现的原因可能是真菌大多作为分解者的角色存在于土壤中，但是生物炭作为一种极难分解的惰性碳，短时间内真菌对于生物炭无法达到充分有效的利用。

农田土壤真菌群落尤其是优势类群与耕作土壤类型、耕作措施以及施肥因素等密切相关。镉污染稻田土壤的优势真菌类群是子囊菌门和担子菌门，本结果与李红宇等的研究结果一致。壶菌门在单施生物炭处理时相对丰度显著性提高，与刘师豆等的研究结果一致。担子菌是土壤中的重要分解者，在土壤中以腐生、寄生和共生的营养方式生存，其功能是分解木质化植被碎屑，有着很好的分解植物残体中的木质纤维素的能力，生物炭配施化肥处理能够较对照组显著提高担子菌门的相对丰度，表明生物炭配施化肥处理能够对镉污染土壤理化环境产生影响，提高部分菌门的相对丰度，利于腐生菌群成长。

通过RDA分析及Pearson分析进一步明确影响群落结构变化的环境因子，生物炭和化肥的添加改变了真菌群落结构，且高量生物炭处理对真菌群落结构的影响更为显著；土壤pH值、全氮含量及土壤碳氮比对真菌群落结构具有显著影响。单施生物炭处理及化肥减量配施生物炭处理显著降低了镉污染土壤镉含量，同时配施化肥处理，能够在丰富土壤养分含量的同时，利用生物炭具有较强的吸附性对土壤中的P、K、Mg等不同存在形态的营养元素产生吸附作用，丰富了土壤中有效性营养元素的含量，为真菌提供养分来源；同时，生物炭及化肥配施处理的情况下，土壤pH值得到调节，并且土壤中的碳、氮水平在生物炭及化肥的施加处理下，可以调节土壤真菌对其的利用能力，增加土壤相关酶的活性，从而影响真菌群落结构。

单施生物炭及化肥减量配施生物炭处理能够降低镉污染土壤镉含量，并有助于改善土壤养分。生物炭及配施化肥处理对土壤真菌群落多样性及丰富度无显著性影响，生物炭配施化肥处理较对照处理显著提升了担子菌门的相对丰度，单施生物炭显著提高了壶菌门的相对丰度。土壤pH值、全氮含量及土壤碳氮比是水稻土壤真菌群落分布的重要影响因素。