EGCG诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡作用的研究

邱梅园，丁芝祥，靳 荷，蒋姣姣

0引言

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞是视网膜神经细胞和脉络膜之间的单层上皮细胞层，对视网膜的内在平衡至关重要。它构成了视网膜生物屏障，对神经视网膜的光感受器有支持作用，此外也具有运输营养物质及免疫赦免等功能[1]。因此，RPE的异常变化会引起其功能紊乱，导致光感受器的退化及视力的丧失，最终导致增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)或年龄相关性黄斑变性等疾病的发生。PVR是视网膜脱离的并发症之一，其主要原因是由于RPE细胞、巨噬细胞和纤维母细胞等的大量增殖，其中RPE细胞的增殖被认为是PVR发生发展最主要的原因，RPE细胞异常增生使其迁移至玻璃体腔和玻璃体视网膜交界处，逐渐形成视网膜前膜，进而牵拉视网膜，最终导致视网膜脱离及视力损害。此外，在PVR发展之前，RPE细胞异常增殖及迁移的相关表型也难以回到正常状态。因此，如何控制PVR的发展仍是一个难题。近年来，PVR的研究热点是借助细胞凋亡途径控制RPE细胞的增殖，或施加凋亡诱导剂，使增殖及迁移的细胞发生凋亡，进而遏制PVR的进展。绿茶多酚提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是绿茶多酚提取物儿茶素(catechin)的主要成分，约占儿茶素的80%，具有很强的抗氧化能力。同时，研究表明低浓度EGCG对紫外线等因素引起的RPE细胞凋亡具有抵抗作用。而EGCG单独使用对RPE细胞起到什么作用尚不清楚。本实验应用不同浓度EGCG作用于体外培养的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)，探讨EGCG对RPE细胞的促/抗凋亡作用，并观察其对凋亡相关因子B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)、BCL2-Associated X的蛋白质(Bax)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)等因子的mRNA及蛋白水平的影响，评价EGCG对PVR早期防治的应用价值。

1材料和方法

1.1材料EGCG(中国药品生物制品检定所)；ARPE-19株购买于武汉大学细胞库中国典型培养物保藏中心(武汉);青链霉素混合液(100×)(含青霉素10U/L，含链霉素10μg/L)购自武汉博士德生物公司;DMEM培养基、小牛血清和胰蛋白酶均购自GIBCO公司;鼠抗β-actin单克隆抗体(上海碧云天);兔抗bcl-2、caspase-3、p53多克隆体(abcam公司)；兔抗Bax多克隆抗体(abmart)、ECL试剂盒(美国伯乐公司)。Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒(美国BD公司)，蛋白定量分析试剂盒(上海碧云天生物有限公司)。流式细胞仪(美国BD FACScan)；倒置荧光显微镜IX-71(日本Olympus公司)；细胞培养箱(美国thermo公司)；冷冻高速离心机(美国thermo公司)，蛋白电泳及转印系统(美国伯乐公司)，酶标仪(瑞士TECAN公司)。

1.2方法

1.2.1EGCG溶液配制将EGCG用PBS配制成16mg/mL的母液，0.22μm的滤膜过滤除菌，用完全培养基稀释成40、80、160μg/mL三个浓度。

1.2.2ARPE-19细胞株培养调整密度为每毫升5×104个细胞接种到培养瓶中，在37℃，5%CO2条件下常规培养，培养基为含10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基。

1.2.3hoechst33258荧光染色取对数生长期的ARPE-19，以每孔4×104个细胞种于6孔板内，EGCG干预48h后，将6孔板内的培养基吸出，PBS洗两遍，4%的多聚甲醛室温固定15min，PBS洗两遍后，加入用PBS(1∶1 000)稀释hoechst 33258，37℃孵育20min。PBS洗两遍后，荧光显微镜下观察拍照，注意操作时动作轻柔，以免凋亡细胞被洗掉。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率EGCG处理细胞48h后，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤后离心，转移到1.5mL EP管内，先将10×结合缓冲液用去离子水稀释成1×结合缓冲液，每管加100μL稀释好的结合缓冲液，各加入5μL Annexin V-FITC和PI，室温避光染色30min，再加入100μL稀释好的结合缓冲液，筛网过滤，流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.2.5实时荧光定量PCR检测细胞Bax和caspase-3及p53的mRNA表达EGCG处理细胞48h后收集细胞，PBS洗涤，加入Trizol试剂，提取总RNA，鉴定RNA纯度和浓度，按RNA试剂盒要求依次加入试剂，将总RNA逆转录成cDNA，后按荧光定量扩增试剂盒要求依次加入引物和反应试剂，ABI7500fast荧光定量PCR仪上机检测，反应条件:50℃ 2min，94℃ 15min；94℃ 15s，60℃ 1min(采集荧光)，40个循环。将β-actin设为内参，正常组设为1，以p53，Bax，caspase-3的2-ΔΔCt反映目的基因mRNA相对表达水平。

1.2.6Westernblot法检测细胞蛋白表达收集EGCG处理48h后的细胞，PBS洗2次，加入细胞裂解液，提取总蛋白，离心取上清，BCA方法测定蛋白浓度。SDS-PAGE胶电泳后，将蛋白转移至NC膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入bcl-2、Bax、caspase-3和p53的一抗(1∶1 000)孵育过夜，加入稀释合适浓度的二抗，室温孵育反应后洗膜，胶片发光显影后定影扫描。以β-actin作为内参，用目的蛋白灰度值/内参灰度值反映蛋白的相对表达水平，实验重复3次。

2结果

2.1hoechst33258荧光染色hoechst 33258染色观察是否有凋亡小体的出现，结果发现随着EGCG浓度的升高，凋亡细胞也逐渐增多，荧光染色变高亮浓缩，并可见明显的凋亡小体，见图1。

图1 hoechst 33258荧光染色分析不同浓度EGCG诱导ARPE-19内的凋亡小体 箭头所示凋亡小体。

2.2流式细胞仪检测不同浓度EGCG诱导ARPE-19凋亡情况不同浓度EGCG组间凋亡率比较差异有统计学意义(F=168.409，P<0.01)，见表1。组间的两两比较采用LSD-t检验，80、160μg/mL组与对照组和40μg/mL组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，80μg/mL组与160μg/mL组比较差异有统计学意义(P<0.01)，40μg/mL组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 流式细胞仪检测不同浓度EGCG诱导ARPE-19凋亡情况 bP<0.01 vs对照组; dP<0.01 vs 40μg/mL。

2.3实时荧光定量PCR检测不同浓度EGCG凋亡相关因子的mRNA表达不同浓度EGCG处理ARPE-19后，能够显著上调p53，Bax和caspase-3 mRNA的表达。不同浓度EGCG各组间Bax、caspase-3、p53的mRNA表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)，两两比较结果见表1，图3。

图3 实时荧光定量PCR分析不同浓度EGCG凋亡相关因子的mRNA表达 A:Bax;B:caspase-3;C:p53；aP<0.05, bP<0.01 vs对照组。

2.4Westernblot检测不同浓度EGCG凋亡相关蛋白的表达EGCG作用ARPE-19 48h后，Western blot检测bcl-2、Bax、caspase-3和p53的蛋白表达情况，随着剂量的增加，EGCG可明显抑制bcl-2的蛋白表达，而显著增强Bax，caspase-3和p53的蛋白表达，见图4。不同浓度EGCG各组间bcl-2、Bax、caspase-3和p53的蛋白表达比较差异均有统计学意义(P<0.01)，两两比较结果见表1。

图4 Western blot检测不同浓度EGCG凋亡相关因子蛋白表达 A:bcl-2;B:Bax;C:caspase-3;D:p53。bP<0.01 vs对照组。

表1 各组凋亡率和各因子mRNA及蛋白表达比较

3讨论

PVR是孔源性视网膜脱离最严重的并发症之一，易造成视网膜结构的变形以及视网膜复位手术的失败，严重的可以导致视功能丧失或失明[2]。RPE细胞是PVR发生发展中公认的最重要的细胞成分，RPE是视网膜10层结构的最外层，构成了视网膜的外屏障。正常情况下，RPE细胞是静止的，但是若在受损伤的情况下可发生增殖和迁移，是PVR恶化的原因之一，因此早期抑制RPE细胞的增殖成为近年来PVR防治研究的主流趋势和热点。目前，临床上尚没有疗效确切的药物用于PVR的治疗，各种抗增殖、抗代谢的药物因毒性大、副作用多等问题限制了其进一步的临床应用[3-4]，目前这类药物尚处于实验研究阶段[5]，因此，寻求新的治疗PVR的途径提上日程，成为当前研究的热点。EGCG是绿茶多酚提取物儿茶素的主要成分，约占儿茶素的80%，具有特殊的立体化学结构[6]。大量研究表明茶多酚具有很强的抗氧化能力，一直作为天然的食品抗氧化添加剂，具有抗氧化、抗肿瘤[7-8]、清除氧自由基等多种生物活性作用，有良好的应用前景[9]。诱导RPE细胞凋亡能够很好的抑制细胞的增殖及转移[10]，Cao等[11]利用50μmol/L(约23μg/mL)浓度的EGCG作用于受到紫外线处理的RPE细胞，结果表明该浓度的EGCG对紫外线引起的RPE细胞凋亡具有保护作用，该实验中仅用了一个浓度。但其他浓度或更高浓度的EGCG单独使用对RPE细胞是否具有不同的作用尚不清楚。本文利用40、80、160μg/mL的EGCG单独作用于体外培养的ARPE-19[12]，检测了细胞凋亡相关的指标，目的是全面了解EGCG对ARPE-19的作用。

EGCG作用ARPE-19 48h，普通显微镜下观察发现随着药物溶度的增高，ARPE-19数量逐渐减少，并且变圆，乃至细胞从培养皿上脱落下来，为了证实细胞是坏死还是凋亡，我们利用hoechst 33258进行染色，发现使用的160μg/mL的EGCG能诱导ARPE-19的凋亡小体出现，说明160μg/mL的EGCG能够诱导ARPE-19发生凋亡，流式细胞仪进一步分析表明，160μg/mL EGCG能够诱导21%左右的ARPE-19发生凋亡。细胞凋亡的发生，往往伴随着促凋亡因子表达的增多以及抑制凋亡因子表达的减少[13-15]。caspase-3、Bax和p53是属于促凋亡细胞因子，当凋亡发生时，常常伴随着这些因子表达的升高[16-18]。Bcl-2细胞因子是属于bcl-2家族的一员，与细胞凋亡密切相关，是一种非常重要的抑制凋亡的细胞因子[16, 19]。本研究发现，80和160μg/mL的EGCG干预ARPE-19后，也伴随着caspase-3、Bax、p53和Bcl-2的表达改变。实时荧光定量PCR及Western blot实验结果显示，随着EGCG浓度的增高，促凋亡因子caspase-3、Bax和p53的表达增多，而抑制凋亡因子bcl-2的表达减少，这说明80和160μg/mL的EGCG在诱导ARPE-19发生凋亡的同时，上调caspase-3、Bax和p53的表达，下调bcl-2的表达，EGCG诱导ARPE-19凋亡的机制与caspase-3、Bax，p53和bcl-2等细胞因子的表达改变有关。

上述结果表明80和160μg/mL的EGCG具有促进ARPE-19凋亡作用，有望用于抑制因RPE细胞异常增殖引起的PVR病变。但仍然有诸多问题需要进一步研究。比如，该浓度EGCG对其他细胞，尤其是视网膜内的其他细胞是否具有促凋亡作用。如果EGCG对其他细胞也具有促凋亡作用，其应用就受到极大的限制。需要进一步检测恰当的浓度，使得该浓度EGCG只引起RPE细胞凋亡，而对其他细胞没有影响，这样才具有临床应用价值。由于EGCG是一种多靶点的抑制剂，其对RPE细胞的作用机制及靶点还远未完全阐明，这些细胞因子之间的上下游关系以及相互联系如何尚需进行更深入的研究。