高维松,陈荣,吴国志,王隆辉,吴昌新
(海南医学院第二附属医院 骨科,海南 海口 570311)
骨关节炎又称退行性骨关节病,以关节软骨缺损、进行性软骨变性为主要病理表现,现已成为世界第4 大致残性疾病。骨关节炎发病机制尚未完全阐明,目前临床多采用对症治疗、保守治疗等,患者症状可得到部分缓解,但疗效不佳[1-2]。因此探寻有效药物提高骨关节炎疗效有重要临床意义。塞来昔布是一种非甾体类抗炎药,具有抗炎、解热等作用[3]。熊应宗等[4]研究显示,塞来昔布治疗骨关节炎短期和远期疗效显著,且安全可行。目前有关塞来昔布对骨关节炎的作用机制尚未明确。有研究证实,软骨细胞凋亡是骨关节炎发生、发展的关键,而软骨细胞外基质过度降解是软骨细胞凋亡的主要原因之一[5]。目前有关塞来昔布对骨关节炎软骨细胞生物学功能的影响少见报道,因此本研究探究塞来昔布对膝骨关节炎软骨细胞增殖及凋亡的影响,并分析相关机制,以期为膝骨关节炎的治疗提供参考。
膝骨关节炎软骨组织取自2021年1月—2021年12月在海南医学院第二附属医院就诊的10 例(男、女各5 例)重度膝骨关节炎行膝关节置换患者。正常膝骨关节软骨组织取自同期本院5 例因下肢严重创伤后需截肢治疗的患者(男性3 例,女性2 例,均无膝骨关节炎病史)。本研究经医院医学伦理委员会审批并通过(No:2021-016)。
塞来昔布,纯度:≥98%,批号:20200913(上海吉至生化科技有限公司),DMEM 培养基(上海吉至生化科技有限公司),甲苯胺蓝染液、AnnexinVFITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(上海玉博生物科技有限公司),兔抗人表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、P38 丝裂原激活蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase, P38 MAPK)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)及β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体、山羊抗兔HRP 二抗(上海臻科生物科技有限公司)。
Optima™XPN 超速离心机(美国贝克曼库尔特生物科技有限公司),NBI1000 型倒置荧光显微镜(南京先纳光学仪器有限公司)。
1.3.1 人膝骨关节炎软骨细胞分离及培养将人膝骨关节炎软骨组织、人正常膝骨关节组织分别置于含双抗的DMEM 培养基中,PBS 洗涤3 次,削取软骨组织块,剪碎至大小约1 mm×1 mm,于0.2%Ⅱ型胶原酶消化液中,37℃、5%二氧化碳环境下消化;消化结束后,4℃、3 000 r/min 离心10 min,弃上清液,用DMEM 培养基冲洗,离心弃去上清液,重复操作3次。加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM 完全培养液,过滤细胞悬液,吹打悬液均匀后,接种于25 m2培养瓶中,每隔1 天更换培养基。当细胞融合至70%~80%时,用PBS 洗涤2 次,0.25%胰酶消化,镜下观察细胞形态呈圆形漂浮流动时终止消化,离心取细胞,用含10% FBS 的DMEM 完全培养基重悬细胞,细胞接种在新的培养瓶中传代培养[6]。上述细胞均至第3 代时用于后续实验。
1.3.2 甲苯胺蓝染色第3 代软骨细胞长至80%左右时,消化、离心,制成密度为1×105个/mL 的细胞悬液,接种于24 孔板(1 mL/孔,孔板提前放置盖玻片),待细胞长至盖玻片70%左右时,取出盖玻片,用4%多聚甲醛固定20 min,PBS 洗涤3 次,1%甲苯胺蓝溶液染色30 min,纯水冲洗掉多余染液,脱水封片,倒置显微镜观察并拍照[7]。
1.3.3 细胞分组取第3 代人膝骨关节炎软骨细胞、人正常膝骨关节软骨细胞重悬,按1.5×105个/孔的密度接种至48 孔板,待细胞融合约80%时,更换不含FBS 的培养液。细胞分为4 组:①空白对照组:人正常膝骨关节软骨细胞不做特殊处理;②模型组:人膝骨关节炎软骨细胞不做特殊处理;③塞来昔布低、高剂量组:人膝骨关节炎软骨细胞中分别加入含终浓度为50 μmol/L、200 μmol/L 塞来昔布溶液的培养液[8]。继续培养细胞24 h,每孔设置6 复孔,每组实验重复3 次。
1.3.4 CCK-8法检测各组细胞增殖能力取第3 代人膝骨关节炎软骨细胞,消化并按1.5×105个/孔的密度接种至48 孔板,严格按照CCK-8 试剂盒说明书操作,分别于培养24 h 后加入CCK-8 试剂,继续培养2 h,检测490 nm 处各孔细胞光密度(optical density, OD)值,重复3 次,取平均值[9]。细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD 值/空白对照组OD 值)×100%。每组6 个复孔,实验重复3 次。
1.3.5 AnnexinV-FITC/PI 检测各组细胞凋亡取第3 代人膝骨关节炎软骨细胞,PBS 溶液冲洗,弃上清液,制成密度为1×105个/mL 的细胞悬液,取100 μL加入5 μL AnnexinV-FITC 及10 μL PI(20 μg/mL)混匀,孵育30 min,流式细胞仪检测凋亡率。每组6个复孔,实验重复3 次[10]。
1.3.6 Western blotting 检测细胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK 通路蛋白的表达取第3 代人膝骨关节炎软骨细胞,以RIPA 裂解并提取总蛋白,检测浓度及纯度,电泳,转膜,放入5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h,分别加入一抗EGFR、p-P38 MAPK、P38 MAPK、MMP-9、Caspase-3、内参β-actin,均按照1∶500 稀释,4℃过夜,加入HRP 标记山羊抗兔二抗(1∶1 000 稀释),室温孵育1 h,显影、定影,根据各蛋白条带灰度值计算目标基因蛋白相对表达量[11]。
数据分析采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以均数±标准差(±s)表示,比较用方差分析,进一步两两比较用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
甲苯胺蓝染色结果显示,人正常膝骨关节软骨细胞、人膝骨关节炎软骨细胞内均见蓝紫色异染颗粒,细胞核呈深蓝色,细胞质呈浅蓝色;与人膝骨关节炎软骨细胞形态比较,人正常膝骨关节软骨细胞体积较大,形态较规则,蓝紫色异染颗粒较多。见图1。
图1 两组软骨细胞形态学观察 (甲苯胺蓝染色×200)
空白对照组、模型组、塞来昔布低和高剂量组细胞存活率分别为(100.00±0.00)% 、(45.96±6.89)%、(60.69±9.12)%和(82.78±12.45)%,经方差分析,差异有统计学意义(F=47.770,P=0.000)。进一步两两比较结果:与空白对照组比较,模型组,塞来昔布低、高剂量组细胞存活率降低(P<0.05);与模型组比较,塞来昔布低、高剂量组细胞存活率升高(P<0.05);与塞来昔布低剂量组比较,塞来昔布高剂量组细胞存活率升高(P<0.05)。
空白对照组、模型组、塞来昔布低和高剂量组细胞凋亡率分别为(9.98±1.50)%、(36.77±5.52)%、(28.35±4.26)%和(16.58±2.47)%,经方差分析,差异有统计学意义(F=60.236,P=0.000)。进一步两两比较结果:与空白对照组相比,模型组,塞来昔布低、高剂量组细胞凋亡率升高(P<0.05);与模型组比较,塞来昔布低、高剂量组细胞凋亡率降低(P<0.05);与塞来昔布低剂量组比较,塞来昔布高剂量组细胞凋亡率降低(P<0.05)。
空白对照组、模型组、塞来昔布低和高剂量组EGFR、p-P38 MAPK/P38 MAPK、MMP-9、Caspase-3 蛋白相对表达量比较,经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05)。进一步两两比较结果:与空白对照组比较,模型组,塞来昔布低、高剂量组EGFR、MMP-9、Caspase-3蛋白相对表达量升高(P<0.05),p-P38 MAPK/P38 MAPK蛋白相对表达量降低(P<0.05);与模型组比较,塞来昔布低、高剂量组EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相对表达量降低(P<0.05),p-P38 MAPK/P38 MAPK蛋白相对表达量升高(P<0.05);与塞来昔布低剂量组相比,塞来昔布高剂量组EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相对表达量降低(P<0.05),p-P38 MAPK/P38 MAPK蛋白相对表达量升高(P<0.05)。见表1 和图2。
表1 各组细胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK通路蛋白相对表达量比较 (±s)
表1 各组细胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK通路蛋白相对表达量比较 (±s)
注:①与空白对照组比较,P <0.05;②与模型组比较,P <0.05;③与塞来昔布低剂量组比较,P <0.05。
组别空白对照组模型组塞来昔布低剂量组塞来昔布高剂量组F 值P 值Caspase-3 0.36±0.06 1.18±0.18①0.82±0.13①②0.55±0.09①②③49.820 0.000 EGFR 0.29±0.05 1.13±0.17①0.80±0.12①②0.58±0.09①②③56.015 0.000 p-P38 MAPK/P38 MAPK 1.27±0.19 0.31±0.05①0.69±0.11①②0.88±0.13①②③56.672 0.000 MMP-9 0.45±0.07 1.26±0.18①0.99±0.15①②0.63±0.09①②③46.524 0.000
图2 各组细胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK通路蛋白的表达
膝骨关节炎是膝关节软骨进行性破坏、膝关节功能受损的一种退行性病变,目前临床仍缺乏有效治疗方法,导致多数患者关节畸形、活动受限,甚至致残,给患者生活质量及家庭带来严重影响及巨大经济负担[12]。塞来昔布是新一代非甾体抗炎镇痛药,可通过抑制环氧合酶-2 阻止前列腺素类炎症物质产生,发挥抗炎、镇痛作用[13]。王啸等[14]研究显示,塞来昔布可减轻膝关节疼痛、改善膝关节功能,进而对膝关节骨性关节炎发挥治疗作用。马瑞等[15]研究显示,塞来昔布可有效缓解早期膝骨关节炎患者关节疼痛,改善关节功能。目前塞来昔布对膝骨关节炎治疗作用的具体机制尚未明确。有研究表明,软骨细胞是膝关节软骨中主要细胞,能够合成软骨中特异性细胞外基质成分,以及合成代谢及分解代谢所需的多种因子,当软骨细胞外基质降解多于基质合成,则使软骨细胞不能摄取较多营养物质,进而导致软骨细胞凋亡,最终加重膝关节损伤[16]。
本研究体外分离并培养人膝骨关节炎软骨细胞,结果显示,与空白对照组比较,模型组及塞来昔布低、高剂量组人膝骨关节炎软骨细胞存活率降低,细胞凋亡率升高;但塞来昔布低、高剂量组人膝骨关节炎软骨细胞存活率比模型组升高,细胞凋亡率比模型组降低,且塞来昔布高剂量组人膝骨关节炎软骨细胞存活率比低剂量组升高,细胞凋亡率比低剂量组降低,说明塞来昔布可促进人膝骨关节炎软骨细胞增殖,抑制软骨细胞凋亡。EGFR 是一种跨膜受体酪氨酸激酶,是细胞增殖及信号转导的受体之一,其活化可介导关节炎破骨细胞生长、增殖及分化等生物学过程[17]。蒋毅等[18]研究显示,过表达EGFR 可促进类风湿性关节炎破骨细胞生成及滑膜细胞生长。MAPK 是机体广泛表达的丝氨酸/酪氨酸激酶,由3 种激酶复合物组成,其中P38 MAPK是MAPK 家族一员,能够调节关节软骨细胞生长及代谢。既往研究显示,EGFR 可抑制P38 MAPK 发生磷酸化反应,促进下游因子MMP-9 产生,MMP-9 可促进软骨细胞外基质降解,进而诱导细胞凋亡基因Caspase-3 升高,最终促进软骨细胞凋亡[19]。云昕矞[20]研究显示,上调EGFR 表达可抑制P38 MAPK 通路活化并促进软骨细胞凋亡。本研究结果显示,与空白对照组比较,模型组及塞来昔布低、高剂量组人膝骨关节炎软骨细胞EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相对表达量升高,p-P38 MAPK/P38 MAPK 相对表达量降低,但塞来昔布低、高剂量组人膝骨关节炎软骨细胞EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相对表达量低于模型组,塞来昔布高剂量组人膝骨关节炎软骨细胞EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相对表达量低于低剂量组,说明塞来昔布可能通过抑制EGFR 表达,促进P38 MAPK 通路活化,促进离体人膝骨关节炎细胞增殖,抑制细胞凋亡,进而促进软骨细胞生长,对人膝骨关节炎软骨细胞发挥保护作用。
综上所述,塞来昔布能够促进离体人膝骨关节炎细胞增殖,抑制细胞凋亡进而促进软骨细胞生长,对人膝骨关节炎软骨细胞发挥保护作用。其作用可能是通过抑制EGFR表达,促进P38 MAPK通路活化实现的。然而本研究并未能明确塞来昔布对EGFR/P38 MAPK通路的具体调控作用,后期应进行深入阐述。