泡椒制品发酵工艺中发酵菌类的优化与分析

◎ 程艳薇，张蓓林，田时雨，王雪郦，谭书明

（1.贵州农业职业学院 食品与药品系，贵州 贵阳 551400；2.贵州建设职业技术学院，贵州 清镇 551499；3.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025;4.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

泡椒是我国川滇黔地区的传统特色美食，采用发酵工艺制作，民间也称之为“鱼辣子”。其制作工艺简单，具体工艺流程为新鲜辣椒采摘后先清洗干净，再放入盐水中泡制，在多种微生物的共同发酵下最终得到成品泡菜产品。其具有酸辣可口、风味鲜香、营养丰富和刺激食欲的特点，能改善肠道环境、健胃消食、预防风湿性关节炎[1]。近年来，随着“康师傅”“统一”等众多的食品企业采用泡椒作为重要原料，住宿及餐饮行业均使用泡椒来制作“泡椒凤爪”，其需求量持续增加，仅在2016年一年时间里，泡椒凤爪在国内市场的销售量就达到了2.26亿袋[2]。目前，贵州作为辣椒的主要产区，辣椒加工在全国也名列前茅，其中泡椒是贵州辣椒加工产品中的第二大类产品，全省年产量有30万t左右。泡椒因其酸辣可口的口感和突出的营养保健功效，深受人们的喜爱[1]。但当前泡椒大多采用传统工艺自然发酵而成，存在规模小、脆度低、劳动强度大、操作烦琐和产品质量不稳定等问题。针对以上问题，本研究从优质的泡椒中分离优良菌株，进行鉴定到种，并筛选出抗逆性优良、产品脆度高的优势菌株，经喷雾干燥为菌粉后直投式发酵。通过验证，新工艺生产的产品质量口感等方面优于传统工艺生产的产品质量，为我国泡菜工艺发展奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1号和2号样品为贵州省石阡和记绿色食品开发有限公司提供的泡椒；3号和4号样品为菜场出售的当地泡椒制品；5号为CICC直投式泡菜发酵复合菌粉：中国食品发酵工业研究院菌种保藏中心研制。

嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）、干酪乳杆菌 （L. casei）和鼠李乳杆菌（L. rhamnosus）3种纯化冻干菌种，广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。

1.2 实验方法

1.2.1 样品选择方法

以口感较好为选择标准进行样品的选择，利于筛选出优质的菌株。

1.2.2 菌株分离方法

（1）按照培养基配方配制MRS琼脂培养基，调节pH至6.2～6.4，于121 ℃灭菌20 min后，置于无菌操作台上冷却备用。

（2）称取辣椒固液混合样品10 g，分别放入内装90 mL无菌生理盐水且内有玻璃珠的三角瓶中，振摇约20 min，使辣椒样品与水充分混合，将细胞分散。吸取1 mL泡椒悬浊液加入9 mL无菌生理盐水的试管中，混合均匀，并制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7共7种不同稀释度的泡椒溶液以备用。

（3）取10个灭菌的培养皿，取其中一个平板加入0.3 mL灭菌水，作为空白对照。剩余9个平板平均分为3组，分别取10-5、10-6、10-7这3个梯度的溶液 0.3 mL注入平板中，做好标记。将灭菌后MRS琼脂培养基冷却至45 ℃时，注入培养皿中约15 mL，并转动平皿，混合均匀。

（4）待培养基冷却凝固后，翻转平板，至37 ℃的恒温培养箱中培养24～48 h。

（5）将培养后的平板取出，观察其菌落形态。选取具有不同菌落形态的单个菌落，进行编号，分别挑取少许细胞用划线法接种到MRS培养基上扩大培养。最后将分离后的菌接种到斜面上保存（试管用双层保鲜袋密封培养）[3]。

1.3 分析方法

菌种生产能力测定：产酸检测方法参照《乳酸菌分类鉴定及试验方法》[4]；还原糖分解速率检测方法参照《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》 （GB/T 5009.7—2016）。

菌种抗逆能力测定：菌种耐酸性参照吴洁[3]的方法检测；光电比浊法测量细菌数量参照《常见细菌系统鉴定手册》检测[5]；菌种耐盐性能测定参照《微生物实验》检测[6]；细菌素检验参照周俊良[7]的方法检测；分解果胶能力实验参照《水果及其制品中果胶含量的测定 分光光度法》（NY/T 2016—2011）检测。

泡椒成品的检测：还原糖含量参照《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》（GB/T 5009.7—2016）检测；总酸参照《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》（GB 12456—2021）检测；可溶性固形物含量参照《水果和蔬菜可溶性固形物含量的测定 折射仪法》（NY/T 2637—2014）检测；盐分参照《食品安全国家标准 食品中氯化物的测定》（GB 5009.44—2016）检测；亚硝酸盐含量参照《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）检测；吲哚和硫化氢参照黄君红等[8]的方法检测；砷参照《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》 （GB 5009.11—2014）检测；汞参照《食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定》（GB 5009.17—2021）检测；菌落总数、乳酸菌数、大肠杆菌数、金黄色葡萄球菌数和沙门氏菌参照《食品卫生微生物学检验 调味品检验》（GB/T 4789.22—2003）检测；黄曲霉毒素参照《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》（GB 5009.22—2016）检测。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分类鉴定结果

2.1.1 形态学实验鉴定结果

从5份样品中共分离纯化得到乳酸杆菌32株，根据来源进行编号为1-L1、1-L2、1-L3、1-L4、1-L5、1-L6、1-L7、2-L1、2-L2、2-L3、2-L4、2-L5、3-L1、3-L2、3-L3、3-L4、3-L5、4-L1、4-L2、4-L3、4-L4、4-L5、4-L6、4-L7、4-L8、4-L9、4-L10、5-L1、5-L2、5-L3、5-L4和5-L5。分别使用MRS培养基培养，使用双层袋对培养皿进行密封后，放置于37 ℃恒温箱中培养48 h后分别观察菌落特征，并同时对分离纯化菌种进行挑菌涂片，后进行革兰氏染色并镜检。结果 见表1。

表1 乳酸杆菌形态学鉴定结果表

进一步通过形态学鉴定，初步确定6株乳酸菌，从其相同形态的菌株中任取一株菌进行纯化用于进一步的生态学实验鉴定。其基本性质如表2所示。

表2 乳酸杆菌生态学实验结果表

2.1.2 不同菌株生理生化检验结果

不同菌株的菌体形态特征和生态学特性表明以上6株乳酸菌为乳杆菌属。而乳杆菌种的划分主要根据碳水化合物的发酵情况，根据表3中的结果，对照“乳杆菌属内专性同型发酵的种的生理生化特征表”[9]，6株乳酸菌的拟鉴定结果如表4所示。

2.2 菌种分析

2.2.1 产酸能力检测

泡椒是经自然乳酸发酵制作的辣椒产品，酸度不仅起到调味的作用，高酸度还可以增加产品的保藏性。各菌种的产酸能力如图1所示，5-L4、干酪乳杆菌、鼠李乳杆菌和1-L2这4株乳酸杆菌产酸性能较强，其中鼠李乳杆菌产酸性能最强。

表3 乳酸杆菌生化实验结果表

表4 菌株拟鉴定结果表

图1 乳酸菌产酸实验折线图

图2 乳酸菌耐酸实验结果分析图

2.2.2 还原糖分解效率检测

还原糖分解效率对于泡椒产品质量而言十分重要，通过对各菌种的还原糖分解效率进行检测，其结果见表5。1-L7、2-L4、1-L1所耗还原糖相对较慢，消耗还原糖较快的为3-L5、5-L4、干酪乳杆菌、鼠李乳杆菌和嗜酸乳杆菌，而1-L2菌液样品中的还原糖耗量最快，在培养48 h时培养皿中的还原糖已基本耗尽，故3-L5、5-L4、干酪乳杆菌、鼠李乳杆菌、嗜酸乳杆菌和1-L2为相对耗糖速率较快的优势菌株。

表5 48 h还原糖的消耗率表（单位：g/100 mL）

2.2.3 耐酸性检测

优良的乳酸菌株不仅产酸性强，抗逆性也较好，菌株的耐酸性与菌株的产酸量能力有很大关系，一般情况下，耐酸性好的菌株最终的产酸量也较大，故发酵菌株对酸度的耐受性也是选择菌株的一个重要指标[4]。随着发酵过程中pH值降低，菌株生长会受到抑制，整体的产酸速度就会随之下降，故通过耐酸实验，能筛选出产酸能力强、耐酸性能较好的优良发酵菌株。

各菌株的耐酸能力如图2所示，1-L2、3-L5和鼠李乳杆菌耐酸性较强，在pH为2.0时仍生长良好，2-L4、1-L7、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和1-L1的耐酸性能稍弱一些，在pH为3.5情况下仍能正常生长。但当pH降低到2.0时，5-L4的OD值则出现了特殊情况，其数值为负值，即比空白实验低，这是由菌种在这种状态下大量死亡、细胞裂解自溶所造成的。

2.2.4 耐盐能力检测

在发酵过程中，食盐不仅有调味的作用还有防腐的功效，因此发酵菌株对盐浓度的抗逆性也是菌株选择的一个重要指标[6]。对这9株乳酸菌分别进行了耐盐性测定，结果如图3所示。

由图3可知，随着盐浓度的不断增加，OD值逐渐降低，但几乎所有被测菌株在食盐培养基中仍能缓慢生长；5-L4、2-L4、干酪乳杆菌和鼠李乳杆菌还表现出了嗜盐性。目前市场上所销售的发酵辣椒制品中，食盐含量通常在7%～l0%，而口感相对较好的泡椒其食盐含量在7%～8%，检测结果证实，在耐盐性上被测9株菌均能达到市售商品的要求。

2.2.5 细菌素生产能力检测

细菌素是细菌在其代谢过程中合成并分泌到周围环境中的一类有抑菌作用的蛋白质或多肽类物质，乳酸菌代谢也可以产生此类物质，由此乳酸菌在泡椒中可以改善产品的组织状态和风味，其产生的细菌素还有防腐抑菌的效果[10]。故细菌素的生产能力对优化菌种、提高生产效率具有重要意义，因而本实验研究了9株乳酸菌的细菌素生产能力，并从其中筛选出细菌素生产能力强的菌株，为提高泡椒食品安全性提供数据支持。本实验对9株乳酸菌采用牛津杯法测定其产细菌素能力，其检测结果表6所示。

图3 不同盐浓度培养前后OD差值图

表6 细菌素生产能力比较测定结果表

由表6可知，9株乳酸菌中有7株分泌细菌素，但分泌的细菌素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用却各不相同。其中对3种有害菌都有抑菌作用的是3-L5、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李乳杆菌；而1-L2只对大肠杆菌有抑制作用，对其他两种都没有抑制作用。

2.2.6 果胶分解能力检测

剩余果胶含量与乳酸菌分解果胶的能力成反比，因此从图4中可以看出，3-L5、嗜酸乳杆菌和鼠李乳杆菌分解果胶的能力弱，干酪、2-L4、1-L1分解果胶的能力最强，1-L7、1-L2、5-L4分解果胶的能力较弱，最弱的是嗜酸乳杆菌。

2.2.7 乳酸杆菌综合能力比较

对9株乳杆菌的综合性能比较见表7。由表7可知，综合评分较高菌株前三分别为鼠李乳杆菌15分，3-L5 10分，干酪乳杆菌9分，之后为1-L2、5-L4、2-L4和嗜酸乳杆菌。为最大限度保证产品的脆度，经综合分析选用3-L5（食果糖乳杆菌）、嗜酸乳杆菌和鼠李乳杆菌为最终发酵菌种。

图4 乳杆菌分解果胶后剩余果胶含量图

表7 乳酸杆菌的综合性能比较表

2.3 改良菌种发酵质量评价

为验证选育菌种实际加工生产能力，将已分离纯化的优势菌株食果糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李乳杆菌按比例为1∶2∶1（质量比）进行配比，在进口温度为170 ℃，β-环糊精的添加量为2.5%，流速为50 m3·h-1的条件下喷雾干燥成复合发酵剂菌粉，然后采用直投式发酵泡椒，其成品与传统工艺加工的泡椒进行比较。

2.3.1 感官指标比较

参照《食品分析与感观评定》的相关评定方法，随机抽取15名食品专业学生，分为3小组，按色泽（25分）、 口感（25分）、风味（25分）和咀嚼感（25分）进行评分，评分结果见表8。

从表8可以看出，在色泽和咀嚼感两个指标上，采用改良型复合发酵剂发酵的泡椒效果显然比自然乳酸发酵的泡椒要好，这说明直投式复合型发酵剂中不存在产不良色素的微生物，且发酵微生物对发酵底物的利用合理，直投式复合型发酵剂发酵的辣椒大大提高了产品的脆度[11]；在风味和口感上，改良型复合发酵剂发酵的泡椒质量与自然工艺发酵的泡椒类似，说明改良后的新工艺从各个方面都有一定的提高，完全满足目前市场上对于泡椒的口感需求。

表8 泡椒感官评分标准表（单位：分）

2.3.2 理化指标比较

从表9可知，还原糖含量方面，通过改良工艺发酵的泡椒还原糖含量比传统自然发酵法制作的泡椒低，总酸和可溶性固形物的含量相对较高，说明乳酸菌在改良后的新工艺环境中能更好地生长。亚硝酸盐含量上，改良后的新工艺所含亚硝酸盐的含量低于传统自然发酵工艺制作的泡椒，说明改良后的新工艺制作的泡椒更加安全。

表9 成品各指标检测结果对比表

2.4 泡椒成品指标

泡椒在发酵过程中，可能伴随着工艺要求和发酵过程产生某些影响人体健康的物质。食盐含量的高低决定着泡椒的风味和口感，同时过高的含盐量会危害人体健康[12]。部分泡椒中的金属毒素也会导致人体重金属慢性中毒，泡椒中原料和添加剂中的砷也有可能会在泡椒发酵过程中积累，从而危害人体健康[13-14]。而发酵工艺不当、温度过低都会导致微生物大量繁殖，从而产生微生物毒素，影响人体健康[15-16]。因此，对采用改良型复合发酵剂发酵的泡椒进行各项规定指标的检测，结果如表10所示。结果表明，泡椒各项指标均符合国家规定出厂要求，从安全性角度说明采用课题组改良型复合发酵剂发酵的泡椒完全达到食品安全质量要求。

表10 成品各指标检测结果表

3 结论

泡椒成熟过程中，乳酸杆菌为优势菌群。乳酸菌的迅速生长、pH的迅速下降是乳酸发酵优质辣椒的关键。随着时间的延长，盐腌法制作的泡椒产品pH变化缓慢，产品质量不稳定，辣椒的脆度明显下降，质地渐渐变软。为更好地控制产品质量，本研究从优质的泡椒中筛选出产酸能力强、耐盐性较强、产细菌素能力较强以及分解果胶能力弱的优势菌株食果糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李乳杆菌，经验证优势菌株发酵的泡椒质量优于传统泡椒。