基于网络药理学和分子对接分析连朴饮治疗新型冠状病毒肺炎伴胃肠道症状的作用机制*

王琳，郑福增

1.河南中医药大学骨伤学院，河南 郑州 450046； 2.河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450002

新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)流行范围广，传染迅速，并且具有反复性，严重威胁着人类健康[1]。目前，COVID-19的治疗缺少特效药物，现有药物只能减轻症状。中医药在此次疫情中突显了其独特性和重要性。有研究表明，COVID-19不仅具有发热、咳嗽、无力等症状，而且还会侵犯消化系统，合并腹泻、呕吐等症状[2]。连朴饮源于王孟英的《霍乱论》，由黄连、厚朴、石菖蒲、半夏、淡豆豉、栀子、芦根等7味药物组成。本方可清解半表半里之伏火[3]，化湿与清热相结合，疏通胃中湿热壅滞，在治疗COVID-19合并胃肠症状中效果显著。而连朴饮治疗COVID-19伴胃肠道症状的作用机制尚未明确。本研究基于网络药理学与分子对接方法，全面阐述连朴饮治疗COVID-19伴胃肠道症状的主要活性成分、潜在靶标和关键通路，确定潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 获取连朴饮有效成分和对应靶点登录TCMSP数据库(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)，分别检索“半夏”“淡豆豉”“厚朴”“黄连”“芦根”“石菖蒲”和“栀子”，以口服利用度(oral bioavailability，OB)>30%、类药性(drug like，DL)>0.18为筛选条件，筛选连朴饮有效成分及对应靶点。登录Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)匹配靶点，进行标准化命名。

1.2 获取COVID-19和胃肠道症状相关基因登录Genecards数据库(https：//www.genecards.org/)、OMIM数据库(https：//omim.org/)、PharmGkb数据库(https：//www.pharmgkb.org/)、TTD数据库(http：//db.idrblab.net/ttd/)及DrugBank数据库(https：//go.drugbank.com/)，分别以“Novel Coronavirus Pneumonia”“diarrhea”“nausea”和“vomiting”为关键词进行检索，获取疾病基因。

1.3 中药-有效成分-潜在靶点-疾病网络图将连朴饮、COVID-19以及胃肠道症状三者靶点取交集，得到潜在靶点。通过Cytoscape软件构建网络图，计算每个节点度值，获取连朴饮治疗疾病的主要成分。

1.4 蛋白质相互作用 (protein-protein interaction，PPI) 网络和核心靶点获取使用String数据库(https：//string-db.org/cgi/input.pl)对潜在靶点进行PPI网络构建，物种选择人类，最低得分0.4分，下载数据，导入Cytoscape软件，通过CytoNCA插件进行拓扑分析，以中介中心度(betweenness centrality)、接近中心度(closeness centrality)、程度中心性(degree centrality)、特征向量中心度(Eigenvector centrality)、基于局部平均连接度的方法(local average connectivity-based method)以及网络中心性(network centrality)大于中位值为过滤条件，筛选核心靶点。

1.5 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析通过R软件中的ClusterProfiler包对潜在靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析。其中GO分析包括生物过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。

1.6 分子对接验证登录PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)下载核心靶点化学结构，使用Pymol软件去除水分子和小分子配体，使用Autodock软件加氢。登录PubChem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载连朴饮主要有效成分的化学结构，使用ChemBio3D软件进行最小自由能优化。使用Autodock软件进行分子对接，记录最小结合能。

2 结果

2.1 连朴饮有效成分及对应靶点通过筛选获得有效成分半夏12个、淡豆豉1个、厚朴2个、黄连11个、芦根1个、石菖蒲4个和栀子12个，见表1。其中槲皮素(quercetin)为黄连、栀子共有成分，山柰酚(kaempferol)为栀子、石菖蒲共有成分，豆甾醇(Stigmasterol)为栀子、芦根、半夏共有成分，β谷固醇(beta-sitosterol)为半夏、栀子共有成分。标准化命名后共获得有效靶点197个。

表1 连朴饮中有效成分

2.2 连朴饮治疗COVID-19和胃肠道症状的潜在靶点通过检索疾病数据库去除重复靶点，共获取COVID-19靶点1 106个、胃肠道症状相关基因8 302个。将连朴饮有效靶点与两者进行取交集，获取连朴饮治疗COVID-19和胃肠道症状的潜在靶点67个，见图1。

图1 连朴饮、COVID-19和胃肠道症状三者交集靶点

2.3 中药-有效成分-潜在靶点-疾病网络构建使用Cytoscape软件构建中药-有效成分-潜在靶点-疾病网络，见图2。根据节点在网络中的度值，筛选出连朴饮治疗COVID-19伴胃肠道症状的主要化学成分，见表2。

表2 连朴饮核心成分

图2 中药-有效成分-潜在靶点-疾病网络图

2.4 PPI网络和核心靶点获取将潜在靶点输入String数据库，构建PPI网络，见图3。使用Cytoscape软件，对各个节点进行分析，根据中介中心度、接近中心度、程度中心性、特征向量中心度、基于局部平均连接度的方法以及网络中心性均大于中位值来获取核心靶点STAT1、CXCL8、HIF1A、RELA、PTGS2、NFKBIA、CASP3、IL1B、JUN、FOS、PPARG和TP53，见图4。

图3 PPI网络

图4 拓扑分析

2.5 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析通过对潜在靶点的GO功能富集分析、KEGG通路富集分析，笔者发现，连朴饮治疗COVID-19和胃肠道症状涉及1 917个生物过程，包括细胞对化学应激的应答、对氧化应激的应答、对内毒素的应答、对细菌性分子的应答、对金属离子的应答等；涉及35个细胞组成，包括膜筏、膜微域、膜区域、转录调节复合等；涉及137个分子功能，包括泛素样蛋白连接酶结合、细胞因子受体结合、DNA结合转录因子结合、核糖核酸聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合等，见图5。KEGG通路富集分析发现，涉及154条通路，包括脂质和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路和流体剪切应力与动脉粥样硬化等，见图6。

图5 GO功能富集分析(BP、CC、MF)

图6 KEGG通路富集分析

2.6 分子对接下载核心靶点HIF1A(1h2k)、IL-8(2il8)、PTGS2(5kir)、STAT1(7nuf)结构，去除小分子配体、水分子，加氢后，作为受体；因在PubChem数据库未检索到5-hydroxy-7-methoxy-2-(3，4，5-trimethoxyphenyl)chromone化学结构，故下载槲皮素、山柰酚、黄芩苷元、8-异戊烯基-山柰酚及β-谷固醇结构，经最小自由能优化处理后，作为配体。使用Autodcok软件进行分子对接，并用Pymol软件绘图。一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大，结合能≤-5.0 kJ·mol-1作为筛选标准。结果显示，受体配体最低结合能均<-5.0 kJ·mol-1，表明核心靶点与连朴饮有效成分有着良好的结合能力，见表3。靶蛋白与化合物结合的最好形式，包括HIF1A与山柰酚、IL-8 与8-异戊烯基-山柰酚、PTGS2与槲皮素以及STAT1与槲皮素，见图7。

表3 分子对接最低结合能

注：A：HIF1A与山柰酚；B：IL-8与8-异戊烯基-山柰酚；C：PTGS2与槲皮素；D：STAT1与槲皮素

3 讨论

COVID-19是西医病名，中医古籍中并无此类记载，但是根据其一般表现及流行特征，新冠病毒肺炎属中医“疫病”范畴。《素问·刺法论》载：“余闻五疫之至，皆相染易，无问大小，症状相似”，指出了疫病的传染性[4]。本病为感受 “疫戾”之气而发，其基本病机以湿邪为主，热、毒、瘀、痰、虚相关；邪犯太阴，首犯肺系后累及脾，易发生传变。多数人在疾病初期多伴有纳差、恶心、腹泻等消化道症状。中医认为，肺与脾胃及大肠之间联系密切，其在生理、病理方面都可相互影响，整体之间互相为用，相辅相成[5]。有研究发现，消化道症状缓解后，COVID-19肺损伤情况也会改善[6]。因此，在治疗COVID-19时要有中医整体观念，不仅要治肺，也要注重胃肠。有研究发现，连朴饮可抑制ALI模型大鼠炎症因子的表达，保护肺组织[7]。方中运用石菖蒲芳香化湿开胃，黄连清热解毒燥湿，厚朴理气燥湿，半夏燥湿和胃等药物[8]，对COVID-19合并胃肠症状具有良好的疗效。

本研究通过网络药理学技术对连朴饮治疗COVID-19伴胃肠道症状的机制进行了研究，结果提示，连朴饮最主要的活性成分为槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇等。槲皮素介导MAPK信号通路，抑制对氧磷酶2的表达，抵抗氧化应激损伤；通过抑制细胞分泌IL-1、IL-6、IL-10等炎症因子，减少NF-κB的核转位，发挥抗炎作用[9-10]。蔡美云等[11]表明，山柰酚可作用于p38MAPK信号通路发挥抗炎作用，同时山柰酚可减少TSLP、TNF-α、IL-8 等促炎细胞因子的产生和mRNA表达。Liao等[12]发现，β-谷甾醇显著降低nlrp3炎症体的关键成分nlrp3的表达，并抑制Caspase-1的活化，从而起到抗炎作用，β-谷甾醇也可抑制金黄色葡萄球菌[13]。同时，β-谷甾醇还可以使趋化因子IL-8、GRO-α、GRO-β表达明显下降，减轻患者肺部炎症反应[14]。

通过PPI网络分析可以得出，连朴饮治疗COVID-19合并胃肠道症状主要涉及STAT1、CXCL8、HIF1A、RELA、PTGS2等12个核心靶点。STAT1是STAT(信号转导及转录激活子)家族之一，在免疫调节、炎症反应等过程中发挥着重要作用[15]。STAT1参与JAK/STAT信号转导，其磷酸化后促进多基因转录，参与IL-4和IL-13等炎症因子的信号转导过程，活跃下游靶基因的表达从而使气道炎症反应发生[16-17]。CXCL8是一种多效应因子，又称为 IL-8，通过G蛋白偶联受体介导信号通路，趋使多种炎症细胞游走至肺部组织，血管活性物质随之大量释放，引起组织免疫损伤[18-19]。PTGS2又名环氧合酶2，是非甾体类药物的作用靶点之一，在体内细胞中被炎症细胞因子和生长因子等诱导，参与急性炎症的发展以及细胞焦亡、细胞凋亡等多种病理过程[20-21]。

借助GO功能富集分析、KEGG通路富集分析，笔者发现连朴饮治疗COVID-19和胃肠道症状涉及细胞对化学应激的应答、对氧化应激的应答、对内毒素的应答、对细菌性分子的应答等生物过程。KEGG通路富集分析筛选得到的通路主要有脂质和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路和流体剪切应力与动脉粥样硬化等。IL-17通过刺激细胞产生TNF-α和IL-6，然后下调TLR2介导的ERK1/2磷酸化使NF-κB激活，启动炎症和自身免疫反应，同时IL-17还可通过ERK1/2和NF-κB通路导致肺部损伤[22-23]。AGE-RAGE信号通路诱使体内促炎因子的产生与释放，引起组织损伤[24]。由此推测，连朴饮可能通过调控上述通路发挥治疗作用。分子结果对接显示，槲皮素、山柰酚、黄芩苷元、8-异戊烯基-山柰酚及β-谷固醇与HIF1A、IL-8、PTGS2、STAT1均有稳定的结合能力，其中以与PTGS2、STAT1的结合更为稳定，起到治疗COVID-19合并胃肠道症状的作用。

本研究结果表明，连朴饮治疗COVID-19合并胃肠道症状通过多靶点、多途径、多通路等途径调节免疫、抗炎，本文为临床应用连朴饮治疗COVID-19提供了理论依据，同时也为以后探索新的治疗方法提供新的思路。