艾灸关元穴对甲状腺功能减退大鼠的影响*

康春嵋，刘冬，黑伊凡

北京中医药大学第三附属医院，北京 100029

甲状腺功能减退症简称甲减，是指由于甲状腺激素合成及分泌减少或其生理效应不足导致的机体代谢异常的一种疾病，女性发病率高于男性，可出现面色苍白、智力低下、记忆力减退等症状。据统计，我国甲减的发病率约为2%～3%，并发心血管系统、运动系统、消化系统疾病，需及时采取有效的治疗措施控制病情[1]。根据中医学理论，甲减可归属于“虚劳”“水肿”范畴，与先天禀赋不足及后天饮食劳倦、情志不遂、水土失宜密切相关[2]。艾灸是一种中医特色疗法，可温经散寒、补肾助阳、升阳固脱[3]。关元穴位于人体脐下三寸，艾灸关元穴可培本固元、补益下焦，治气血亏虚、阴阳失调之症，研究证实，艾灸关元穴可调节内分泌轴[4]。临床研究显示，灸法治疗甲减效果确切，所选穴位主要包括关元、足三里等[5]，但艾灸关元穴治疗甲减的具体作用及机制仍需要进一步探讨。故此，本研究以甲减大鼠体质量、甲状腺功能指标、甲状腺滤泡上皮细胞的变化为指标，探讨艾灸关元穴对甲减大鼠的影响，以期为此疗法在临床中的推广及应用奠定基础。

1 材料

1.1 动物4周龄SPF级雌雄各半Wistar大鼠60只，体质量70～110 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK(京)-20190004。适应性喂养1周，自由饮食和进水，饲养温度：20～25 ℃，空气湿度：50%～65%，12 h光照12 h黑暗，保持环境安静。本研究经北京中医药大学实验动物伦理委员会审批通过，审批号：BJUCM201911-002。

1.2 药物与试剂丙硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)(南通精华制药股份有限公司，生产批号：171209)；艾灸条(南阳楚艾艾草制品有限公司，规格：直径18 mm，长度200 mm，生产批号：180115)；促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、总三碘甲状腺原氨酸(total triiodothyroxine 3，TT3)、TT4酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒、二甲基亚砜(dimethylsurfoxide，DMSO)溶液、苏木素-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色试剂盒(美国Invitrogen公司，生产批号：180804A、181111C、180917A、20190210、20180617C)；0.25%胰蛋白酶溶液(美国罗氏公司，货号：G198256)；四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(methyl thiazolil tetracolium，MTT)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：190412)；RNase、碘化丙啶(propidium iodide，PI)(美国Bio-Rad公司，批号：201906、201901)。

1.3 仪器PL203型电子天平(瑞士梅特勒公司)；M16型高速离心机(湖南湘仪仪器厂，离心半径：10 cm)；3111型CO2培养箱(美国赛默飞公司)；MK3型酶标仪(美国BioTek公司)；Accuri®C6 Plus型流式细胞仪(美国BD公司)。

2 方法

2.1 动物分组、建模及干预60只雌雄各半Wistar大鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组和艾灸组，每组各20只，模型组和艾灸组给予0.05%PTU喂养建立甲减大鼠模型，空白组正常饮食饮水。当血清高敏促甲状腺激素(sensitive thyroid stimulating hormone，sTSH)>10 IU·L-1时，甲减大鼠模型建立成功[6]。模型建立完成后，艾灸组予以关元穴艾灸，具体操作如下：捆绑大鼠，参照邓春雷《实验针灸学》[7]选穴，脐下15 mm处为关元穴，即脐与耻骨联合上缘3/5交点位置，悬针灸，艾灸需与大鼠皮肤保持1.5 cm距离，艾灸30 min，隔天1次，持续4个月，空白组和模型组均捆绑悬针灸，但不予以艾灸操作。

2.2 大鼠体质量检测采用电子天平于艾灸干预前及艾灸1个月、2个月、3个月、4个月后称量各组大鼠的体质量。

2.3 甲状腺功能指标检测分别于艾灸干预前及艾灸1个月、2个月、3个月、4个月后采用心脏穿刺取血法取血3～4 mL，每次采血时间均限定在 900-1100，以免甲状腺激素分泌的节律性影响检测结果。取血后，3 500 r·min-1离心10 min，取上清置于1.5 mL 离心管中，-20 ℃保存。严格按照试剂盒说明书操作，采用ELISA试剂盒测定各组大鼠TSH、TT3、TT4的水平。

2.4 甲状腺滤泡上皮细胞形态学变化观察艾灸干预结束后采用断头法处死大鼠，迅速取甲状腺组织，固定、透明、石蜡包埋和连续切片(层厚为 4 μm)，HE染色后光镜下观察细胞生长形态。

2.5 甲状腺滤泡上皮细胞增殖抑制率检测采用MTT法检测甲状腺滤泡上皮细胞增殖抑制率。取0.25%胰蛋白酶溶液消化甲状腺组织，过滤并获得滤泡上皮细胞。置于培养基中培养24 h后，弃上清液，每孔加入40 μL MTT溶液，继续培养4 h后，弃上清液，每孔加入200 μL DMSO溶液，微孔板震荡后采用酶标仪于570 nm处检测光密度(optical density，OD)值，并计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率=(1-干预组OD值/空白组OD值)×100%

2.6 甲状腺滤泡上皮细胞凋亡率检测采用流式细胞仪检测甲状腺滤泡上皮细胞的凋亡率。细胞培养24 h后以PBS缓冲液调整细胞密度为1.0×105·mL-1。加入FITC，避光孵育25 min，加入PI(含RNase)后避光孵育5 min，过滤并以流式细胞仪检测，采用配套Cellquest软件分析滤泡上皮细胞凋亡率。

3 结果

3.1 艾灸关元穴对甲减大鼠体质量的影响各组大鼠干预期间均无死亡，模型组和艾灸组均造模成功。干预前，与空白组比较，模型组和艾灸组雌性和雄性大鼠体质量均明显下降(P<0.05)。艾灸干预1个月、2个月、3个月、4个月后，与空白组比较，模型组雌性和雄性大鼠体质量均明显下降(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组雌性和雄性大鼠体质量均明显升高(P<0.05)；与干预前比较，模型组雌性和雄性大鼠体质量均明显下降(P<0.05)，且呈时间依赖性；艾灸组雌性和雄性大鼠体质量均明显升高(P<0.05)。提示艾灸关元穴可升高甲减大鼠的体质量。见表1、表2。

表1 各组雌性大鼠干预期间体质量变化

表2 各组雄性大鼠干预期间体质量变化

3.2 艾灸关元穴对甲减大鼠甲状腺功能的影响干预前，与空白组比较，模型组和艾灸组TSH显著升高(P<0.05)，TT3、TT4显著下降(P<0.05)。艾灸1个月、2个月、3个月及4个月后，与干预前比较，模型组TSH显著升高(P<0.05)，TT3、TT4水平显著下降(P<0.05)，且呈时间依赖性；艾灸组TSH显著降低(P<0.05)，TT3、TT4显著升高(P<0.05)。与空白组比较，模型组TSH显著升高(P<0.05)，TT3、TT4水平显著下降(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组TSH显著降低(P<0.05)，TT3、TT4水平显著升高(P<0.05)。提示艾灸关元穴可增强甲减大鼠的甲状腺功能。见表3、表4、表5。

表3 各组大鼠不同时间TSH变化

表4 各组大鼠不同时间TT3变化

表5 各组大鼠不同时间TT4变化

3.3 艾灸关元穴对甲减大鼠甲状腺滤泡上皮细胞形态的影响空白组大鼠甲状腺滤泡排列均匀、形态规则、中等大小，滤泡上皮细胞整齐排列，多为单层立方体状，滤泡腔内可见丰富的胶质；模型组大鼠甲状腺滤泡排列不规则、呈多形性变化，部分滤泡伴有局部增生，滤泡腔大小不均匀，有红色深染胶质，滤泡上皮细胞部分变矮、且呈扁平状，核呈梭形排列；艾灸组大鼠甲状腺滤泡及滤泡上皮细胞结构病理改变得到明显改善。见图1。

注：箭头所示为甲状腺滤泡上皮细胞形态改变、滤泡腔异常变化

3.4 甲状腺滤泡上皮细胞增殖及凋亡测定与空白组比较，模型组增殖抑制率和凋亡率显著升高(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组增殖抑制率和凋亡率显著下降(P<0.05)，提示艾灸关元穴可促进甲减大鼠甲状腺滤泡上皮细胞增殖并抑制其凋亡。见表6、图2。

表6 甲状腺滤泡上皮细胞增殖抑制率和凋亡率结果

4 讨论

甲减病因复杂，常见的病因有缺碘或甲状腺合成、分泌不足等[8-9]，目前，针对该病常用的西医疗法有甲状腺制剂替代治疗，给氧、控制感染、输液、保护心肌组织等对症治疗，但是甲状腺制剂替代疗法需终身用药，而对症治疗的成效往往不甚理想[10-12]。因此，甲减患者西医治疗仍存在明显的不足与缺陷，需积极探讨新型、高效的治疗方案。

甲减的临床症状主要有畏寒、嗜睡、乏力、肢体肿胀等，其中畏寒、嗜睡属于中医的“阳虚”，乏力、肢体肿胀则属于中医的“气虚”[13]。肾藏精，骨生髓，脑为髓海，肾气不足、髓海不充可致全身乏力、精神萎靡[14]。脾主四肢肌肉，脾气虚弱则四肢无力。脾主运化，肾主水，脾肾阳虚，气血不足，则水液泛溢，肢体肿胀[15-16]。现代中医学家认为，“虚损”贯穿了甲减的病理发展过程[17]，根据虚则补之、损则益之的中医原则，需予以温肾助阳法干预。艾灸有温补阳气、除湿祛瘀之效，关元穴为强壮要穴，是足三阴与任脉之会，其中足三阴是足厥阴肝经、足太阴脾经、足少阴肾经三经，此穴位对应肝、脾、肾三脏，对其艾灸可达益肾固本、补精益气的功效[18-19]。既往报道显示，艾灸关元穴能够对人体全身各器官、免疫系统及内分泌系统产生影响，对人体糖代谢、脂代谢起到不可忽视的作用[20-21]。另有研究指出，艾灸关元穴可以使全身循环系统得到改善，细胞炎症减少，自身免疫力提高，还可活跃老年大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴，对阳虚证有良好的治疗作用[22-23]。因而，采用艾灸关元穴治疗甲减是可行的，可有效控制其症状。

王斌等[24]研究显示，对甲状腺功能减退症大鼠予以左甲状腺钠发现，3个月后大鼠的甲状腺功能显著改善。为观察甲减大鼠的甲状腺功能动态变化，故本研究选择艾灸1个月、艾灸2个月、艾灸3个月和艾灸4个月作为观察时间点。本研究中，干预前模型组、艾灸组体质量、血清TT3、TT4水平均低于空白组，血清TSH水平高于空白组，提示模型组、艾灸组建模成功，且表明罹患甲减可导致体质量、血清TT3、TT4水平下降，而血清TSH水平则显著升高。PTU可通过“缝隙连接”膜通道阻断小分子运动，还可加速甲状腺滤泡上皮细胞凋亡，已在既往研究中证实可用于建立实验性甲减模型[25-26]。本研究中，干预后模型组体质量、血清TT3、TT4水平均持续显著下降，血清TSH水平均持续显著升高，表明罹患甲减后若未得到及时有效的治疗和控制，体质量将会不断显著下降，甲状腺功能异常的程度也将会不断显著加重；干预后不同时刻艾灸组体质量、血清TT3、TT4水平均高于干预前和模型组，血清TSH水平均低于干预前和模型组，且艾灸组上述指标的水平均与空白组接近，提示艾灸关元穴可以改善甲减大鼠体质量下降及甲状腺功能指标。

甲状腺激素主要是由甲状腺滤泡上皮细胞合成和分泌的，其形态、滤泡内腔液体量及状态均与其功能紧密相关[27]。正常情况下，甲状腺滤泡排列整齐、大小均匀，且滤泡上皮细胞呈立方形。当甲状腺功能减退后，滤泡上皮细胞可呈现出变矮、扁平状，其中的胶质状液体含量增加[28-29]。本研究结果显示，空白组大鼠甲状腺滤泡及上皮细胞状态正常，模型组呈显著异常，艾灸组较模型组有明显改善，且与空白组相近，证实模型组和艾灸组甲减模型建立成功，同时也表明艾灸关元穴可促使甲状腺滤泡及上皮细胞的结构与功能恢复正常。在甲状腺滤泡上皮细胞增殖抑制率、凋亡率对比结果中显示，模型组增殖抑制率和凋亡率最高，艾灸组均次之，空白组均最低，提示艾灸关元穴可促进甲状腺滤泡上皮细胞增殖，抑制凋亡。艾灸关元穴不仅能够刺激内分泌轴恢复平衡，还可增强机体抵抗力，减轻甲减对机体造成的危害，推测该疗法是通过改善甲状腺滤泡及上皮细胞的结构与功能发挥调节内分泌、改善甲状腺功能的作用。

综上所述，艾灸关元穴可改善甲减大鼠体质量下降及甲状腺激素紊乱，促进甲状腺组织滤泡及上皮细胞结构与功能的恢复，促进甲状腺滤泡上皮细胞增殖，抑制细胞凋亡。本研究为甲减患者提供一种高效可行的临床治疗方案，但艾灸关元穴发挥上述作用的具体机制及途径尚不明确，仍需要进一步探讨研究。