溴新斯的明舌下膜的制备及体内外评价

王蓉玲，胡华胜，金牮*（.江苏海洋大学药学院，江苏 连云港 005；.江苏谛奇医药科技有限公司，江苏 徐州 006）

药物的临床给药途径主要分为胃肠道给药（如口服）和非胃肠道给药（如注射、经皮和吸入给药等）。口服给药由于携带及使用方便，不会给患者带来生理性不适而具有较高的患者顺应性，但口服给药后药物在胃肠道存在溶解入血，再达到靶点起效的过程，起效较慢，因此对于一些难溶性药物或急性疾病来说，口服给药并不是最佳的给药途径。其次，由于胃肠道环境较为复杂，一些不耐酸碱的药物进入胃肠道后会出现显著的降解现象或明显的首过效应，因此生物利用度较低[1]。注射给药起效快，剂量准确，但由于有创给药方式会给患者带来显著的生理疼痛而具有较差的患者顺应性[2]。因此，对于一些口服生物利用度较差的药物，开发一种无创的非胃肠道给药方式具有非常显著的临床价值，口腔黏膜给药则是这些无创的非胃肠道给药途径的一种，随着新型聚合物及药物传递技术的快速发展，如何安全有效地通过口腔黏膜途径给药而避免复杂的胃肠道环境受到了越来越多医药工作者的关注[3]。

溴新斯的明（neostigmine bromide，NB）是一种可逆性的抗胆碱酯酶药，可抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）活性而发挥完全拟胆碱作用，对骨骼肌及胃肠道平滑肌兴奋作用较强[4]，NB 还可用于对抗竞争性神经肌肉阻滞药过量时的毒性反应[5]，临床主要用于治疗重症肌无力、急性肠梗阻及尿潴留等[6-9]，但本品口服难吸收且不规则，目前临床应用的主要为其注射剂型[9-10]，因注射给药使用不方便，且会给患者带来生理不适，因此，开发其无创非胃肠道给药途径具有极大的市场潜力。本研究旨在开发一种无创非胃肠道给药的新斯的明新剂型，为新斯的明临床用药增加一种新的给药剂型选择的可能。

1 材料

溴新斯的明（damas-beta 公司）；羟丙甲纤维素（HPMC，湖州展望药业有限公司）；聚乙二醇（PEG，山东优索化工科技有限公司）；阿斯帕坦（贵州威门药业股份有限公司）；依地酸二钠（郑州卓创化工产品有限公司）；聚山梨酯（辽宁奥克医药辅料股份有限公司）；二氧化钛（GENERALREAGENT）；肝素（江苏万邦生化医药股份公司）；水为超纯水；甲醇、乙腈、冰醋酸均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

XP-105 电子天平（瑞士梅特勒公司）；YP1002N 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；FE20 型实验室pH 计[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；FA-2020 型全数控小型涂膜机（弗安企业发展有限公司）；TK-20 垂直透皮仪（上海玉研科学仪器有限公司）；LC-20AD岛津液相色谱仪（日本岛津公司）；SOTAX AT7自动溶出仪（瑞士力扬公司）；Mixmate Vortex-Genie-2 G-560涡旋仪（VWR）；AL-104分析天平、XSC105DU 分析天平（梅特勒）；5417R/5810R 离心机（Eppendorf Scientific Industries）；Drict-Q5超纯水机（Millipore）；YGC-16A 全自动氮吹仪、YGC-6A 固相萃取仪（郑州宝晶电子科技有限公司）；SDF-A 小型高速分散机（中达化工机械）。

2 方法

2.1 溴新斯的明的制备

将处方量的HPMC 分散至90 ℃的纯化水中，搅拌溶解，得到无色透明状溶液，冷却至室温后加入处方量的溴新斯的明、PEG、阿斯帕坦、依地酸二钠、聚山梨酯、二氧化钛，搅拌5 min；然后用高速分散机分散7 min（转速为2000 r·min－1），得类白色乳状溶液，超声消泡后加入到连续式涂布机中连续涂膜，干燥后裁剪，得到15 mg/片的溴新斯的明舌下膜剂。

2.2 处方研究设计

在溴新斯的明舌下膜处方中，高分子成膜材料HPMC、增塑剂PEG 与成品的关键质量属性密切相关，为了获得理想的目标处方，固定阿斯帕坦、依地酸二钠、聚山梨酯、二氧化钛的用量，以终产品拉伸强度、崩解时限、体外溶出速率、体外渗透速率为关键评价指标，考察HPMC、PEG 的用量对上述关键评价指标的影响。处方设计见表1。

表1 处方设计(单剂量/mg)Tab 1 Formulation design (single dose/mg)

2.3 崩解时限测定方法

取洁净滤纸用纯化水润湿后平铺于洁净的培养皿中，取1 片成品膜剂放置于上述润湿的滤纸表面，观察并记录成品膜剂全部崩解融化所需要的时间。

2.4 机械性能测定方法

取1片成品膜剂，用夹具夹住膜剂一端并固定，另一端用拉力器在垂直状态下匀速拉伸直至膜剂断裂。拉伸过程中拉力所达到的峰值即为拉伸强度（N），膜剂断裂时两夹具距离即为拉伸长度（cm）。照下式计算膜剂的延伸率（%）：延伸率（%）＝（拉伸长度－原始长度）/原始长度×100%。

2.5 体外溶出测定方法

2.5.1 溶出方法 采用2015年版《中国药典》0931 第二法（浆法）考察各处方体外溶出行为。介质为人工唾液（分别称取氯化钙0.2 g、氯化钠0.5 g、氯化钾0.8 g、磷酸氢二钾0.5 g、磷酸二氢钾0.5 g、HPMC 0.2 g，置1000 mL 量瓶，用纯化水溶解摇匀，即得），介质体积为500 mL，搅拌桨转速为50 r·min－1，介质温度（37±0.5）℃，取样时间点为1、3、5、8、10、15 min。

2.5.2 样品制备 取各处方片剂12 片照拟订溶出方法制备溶出液，溶出液过PVDF 针头式滤膜（0.8 µm），取滤液作为供试品溶液；另精密称取溴新斯的明适量，用人工唾液溶解并稀释制成质量浓度为0.03 mg·mL－1的溶液，作为对照品溶液。

2.5.3 色谱条件及分析 色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 采用乙腈-20 mmol·L－1磷酸二氢钾溶液（磷酸调pH值至3.0）（10∶90）等度洗脱；检测波长为220 nm；柱温为35 ℃；流速为1 mL·min－1；进样体积为10 μL。分别精密量取供试品和对照品溶液进样分析，按外标法计算各时间点药物溶出量并绘制溶出曲线。

2.6 体外渗透率测定方法

采用Franz 模型评价自制溴新斯的明的体外稳态渗透速率。猪口颊黏膜在组成、形态、通透屏障功能等特性与人体最为接近，因此选择猪口颊黏膜作为溴新斯的明舌下膜的体外渗透研究模型。

2.6.1 猪口颊黏膜处理 将电休克的猪口颊小心取下，用pH 7.0 的PBS（取磷酸二氢钾0.68 g，加0.l mol·L－1氢氧化钠溶液29.l mL，用水稀释至100 mL，即得）冲洗干净，仔细去除黏膜下组织，分离出厚度约600 ～800 µm 的黏膜层，置于pH 7.0 的PBS 中备用。

2.6.2 评价模型 Franz 扩散池（12 通道），药物池为2 mL 人工唾液，接收池为pH 7.0 的PBS（10 mL）。整个装置置于有磁力搅拌功能的37℃恒温水浴锅中，为避免封闭的接收池形成浓度梯度，在接收池中放置磁力搅拌子，转速为300 r·min－1。

2.6.3 样品制备 取各处方片剂12 片（规格：0.2 mg）分别置于药物池，系统稳定后开启实验，分别于1、2、3、4、5、6、7 h 末取样1 mL（同时补充等体积等温的接收介质），过PVDF 针头式滤膜（0.25 µm），取滤液作为供试品溶液；另精密称取溴新斯的明适量，用pH 7.0 的PBS 溶解并稀释制成质量浓度为0.5 mg·mL－1的溶液，作为对照品溶液。

2.6.4 测定分析 分别精密量取供试品和对照品溶液按“2.5.3”项下条件进样分析，按外标法计算各时间点药物单位面积的累积渗透量。

2.6.5 数据分析 以单位面积累积渗透量为纵坐标，时间为横坐标作图，获得药物累积渗透曲线，按以下公式计算药物的稳态渗透速率：P＝ΔQ/AΔt，式中：P为稳态渗透速率，ΔQ为Δt时间内累积透过黏膜的药物量，A为药物透过黏膜的有效面积。

2.7 大鼠体内药动学研究

以自制溴新斯的明注射液（R1，规格：15 mg·mL－1）和市售溴新斯的明片（R2，规格：15 mg）为参照药物，比较自制溴新斯的明舌下膜（T，规格：15 mg，处方F3）与参照药物在大鼠体内药动学参数的差异。

2.7.1 动物 大鼠24 只，6 ～7 周，体质量190 ～220 g（江苏华创信诺医药科技有限公司），实验动物生产许可证号[SCXK（苏）2020-0009]。

2.7.2 给药方案 将大鼠随机分为T 组、R1组、R2组3 组，每组8 只。给药前，所有大鼠腹腔注射氯胺酮麻醉（30 mg·kg－1），麻醉后R1组大鼠静脉注射自制溴新斯的明注射液1 mL，R2组大鼠灌胃给予溴新斯的明片，T 组大鼠舌下给予自制溴新斯的明舌下膜。各实验组给药后分别于5、15、30、45 min 及1、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h 从大鼠眼底取血0.3 mL，将收集的血液样品置于含肝素的离心管内，离心10 min（5000 g）后收集血浆，收集的血浆保存于－70℃冰箱中备用。

2.7.3 色谱条件[11]PHENOMENON SCX C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为35℃；流动相为0.5 mol·L－1磷酸二氢钠（用磷酸调节pH 至3.5）-乙腈（45∶55，V/V），等度洗脱；流速为1 mL·min－1；检测波长为200 nm。

2.7.4 线性关系考察 取溴新斯的明适量，用甲醇溶解并稀释成1 mg·mL－1的储备溶液。精密量取储备溶液适量，用水稀释成50 μg·mL－1的溴新斯的明溶液，作为内标溶液；另精密量取储备溶液适量，用空白血浆稀释成质量浓度分别为0.3、1、3、5、10、30、50 μg·mL－1的系列溶液，进样测定，以质量浓度对峰面积作线性回归，得回归方程为A＝0.0306C＋0.079（R2＝0.9984），溴新斯的明在0.3 ～50 μg·mL－1与峰面积呈良好的线性关系。血浆样品中溴新斯的明的回收率为（79.84±3.52）%，定量限和检测限分别为0.10、0.05 μg·mL－1。

2.7.5 样品处理 移取血浆200 μL，加入20 μL内标溶液，混合均匀后注入预先依次用0.5 mL 的5%甲醇冰醋酸溶液、0.5 mL 的甲醇溶液、0.5 mL的0.2 mol·L－1磷酸氢二钠溶液（用氢氧化钠调节pH 至9）活化好的PHENOMENON 固相萃取柱（Strata-X-CW 33 u，10 mg·mL－1），先用1 mL 的0.2 mol·L－1磷酸氢二钠溶液（用氢氧化钠调节pH 至9）-甲醇（90∶10，V/V）洗脱，弃去洗脱液，然后用1 mL 的5%甲醇冰醋酸溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液用氮气流（40℃）吹干后，残留物用100 μL流动相溶解，涡漩混合后取20 μL 进样分析。

2.7.6 样品测定及结果分析 记录溴新斯的明的峰面积，用标准曲线计算出样品中溴新斯的明的浓度，用WinNonLin（6.3 版，Pharsight）按照房室模型计算药动学参数。

3 结果

3.1 处方变量对样品机械性能及崩解时限的影响

处方变量对样品机械性能及崩解时限影响的测定结果见表2。结果表明，HPMC 的用量对产品的拉伸强度有显著影响，随着HPMC 用量的增加，样品的拉伸强度也增加；PEG 的用量对样品的延伸率影响显著，随着PEG 用量的增加，样品的延伸率也增加；在筛选量范围内，HPMC 及PEG 用量对样品的崩解时限几乎无影响。

表2 处方变量对样品机械性能及崩解时限的影响(n ＝12)Tab 2 Effect of formulation variables on the mechanical property and disintegration time limit (n ＝12)

3.2 处方变量对样品体外溶出的影响

处方变量对样品体外溶出行为影响的测定结果见表3。在筛选量范围内，HPMC 及PEG 用量对样品的体外溶出行为的影响可以忽略不计。

表3 处方变量对样品体外溶出行为影响的考察结果(n ＝12)Tab 3 Effect of formulation variables on dissolution behavior of samples in vitro (n ＝12)

3.3 处方变量对样品体外渗透速率的影响

处方变量对样品体外渗透速率影响的测定结果见表4。结果表明，在筛选量范围内，HPMC比例越大，样品的体外渗透速率越高；而PEG 对样品整体的渗透速率几乎无影响。

表4 处方变量对样品体外渗透率影响的考察结果(n ＝12)Tab 4 Effect of formulation variables on the in vitro permeation rate of samples (n ＝12)

3.4 大鼠体内药动学研究结果

用WinNonLin（6.3 版，Pharsight）按照房室模型计算药动学参数，结果见表5 及图1。自制溴新斯的明舌下膜（处方F3）、溴新斯的明片的绝对生物利用度分别为91.76%、32.69%，表明与口服途径相比，舌下给药的生物利用度具有显著优势。

图1 溴新斯的明在大鼠体内的平均浓度-时间曲线（n ＝24）Fig 1 Mean concentration-time curve of neostigmine bromide in the rats plasma after different routes of administration（n ＝24）

表5 溴新斯的明在大鼠体内主要药动学参数(±s，n ＝24)Tab 5 Pharmacokinetics parameters in rats of neostigmine bromide(±s，n ＝24)

表5 溴新斯的明在大鼠体内主要药动学参数(±s，n ＝24)Tab 5 Pharmacokinetics parameters in rats of neostigmine bromide(±s，n ＝24)

组别AUC（0 ～t）/（mg·h·L－1）AUC（0 ～∞）/（mg·h·L－1）Cmax/（mg·L－1）tmax/hF/%T 组16.22±0.51 16.58±0.62 2.41±0.05 2.00±0.12 91.76 R1 组17.83±0.52 18.07±0.67 5.35±0.07 0.75±0.24/R2 组 5.63±0.38 5.91±0.35 0.56±0.02 4.00±0.19 32.69

4 讨论

口腔黏膜由于未角质化，且血管密集，血流丰富，药物在溶解后能快速透过黏膜进入血液循环而发挥疗效，使用过程中不需要额外辅助且不会给患者带来生理性不适，因此口腔黏膜给药越来越受到患者欢迎[12]。

溴新斯的明临床用途广泛，属于临床一线急救用药，目前临床剂型为注射剂和口服片剂，患者选择性较少，开发其新剂型具有显著的临床价值。本研究开发了一种溴新斯的明的舌下膜剂型，采用HPMC 作为成膜材料，PEG 作为增塑剂，另外处方中还加入矫味剂、遮光剂、稳定剂等功能性辅料，在制备过程中，使用高速分散机使药物和辅料分散均匀，保证了成品含量的均一性，检测结果显示，当处方中HPMC 和 PEG 的比例为50∶9 时（F3），所制备的膜剂的机械性能、体外溶出行为以及体外稳态渗透速率最佳。采用处方F3 制备溴新斯的明舌下膜剂，并与溴新斯的明注射剂和片剂开展大鼠体内药动学研究，结果自制溴新斯的明舌下膜（处方F3）、溴新斯的明片的绝对生物利用度分别为91.76%、32.69%，表明舌下给药较口服给药具有显著的生物利用度优势，能极大减少非胃肠道给药剂量，降低不良反应，同时舌下途径这种无创给药方式亦能极大提高患者的用药依从性。