广东省江门市‘新会柑’叶斑病病原菌鉴定

崔一平, 彭埃天, 宋晓兵, 陈 霞, 程保平, 凌金锋

(广东省农业科学院植物保护研究所, 农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室， 广东省植物保护新技术重点实验室, 广州 510640)

‘新会柑’Citrusreticulata‘Chachiensis’又称茶枝柑,属于芸香科柑橘属,是广东省江门市新会区著名的土特产,中国地理标志产品之一。‘新会柑’果皮储藏的时间越久越好,存期3年及以上的称为陈皮。陈皮具有重要的食用价值和药用价值,是我国最常用的中药品种之一[1]。

目前我国已经报道的柑橘真菌性叶斑病种类达30余种,如链格孢Alternariaalternata引起的柑橘褐斑病和柑橘黑腐病,柑橘叶点霉菌Phyllostictacitricarpa引起的柑橘黑斑病,疫霉Phytophthorapalmivora和P.nicotianae引起的柑橘褐腐病等[2-7]。2018年5月到6月期间,笔者在广东省江门市新会区‘新会柑’种植园进行病害调查时发现,很多柑橘叶片上出现叶斑病的症状,主要表现为不规则的、带有黄色晕圈的棕褐色斑点,且在幼嫩叶片上较多,严重影响柑橘叶片的光合作用等功能,从而影响柑橘树体的营养吸收和果实的产量、品质。

为明确引起‘新会柑’叶斑病的病原菌,采集发病的叶片进行组织分离和致病性测定,并采用形态学特征结合多序列系统发育分析对分离所得的病原菌进行鉴定,以期明确引起该病害的病原菌,为病害的有效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物:2018年春季分别在广东省江门市新会区的3个‘新会柑’种植园中,从10个枝条上选取10片发病‘新会柑’叶片进行叶斑病病原菌的分离鉴定;健康‘新会柑’植株购自广东省农业科学院果树研究所,后种植于温室灭菌土壤中,在自然光照下进行培养。

培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基购自广东环凯生物科技有限公司,称取40.1 g,加去离子水定容至1 000 mL;高压锅121℃灭菌20 min。马铃薯葡萄糖(potato dextrose,PD)培养基购自广东环凯生物科技有限公司,称取24 g,加去离子水定容至1 000 mL;高压锅121℃灭菌20 min。

试剂及仪器:动植物全基因组DNA提取试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司;PCR试剂2×EasyTaqPCR Super Mix (-dye) 购自北京全式金生物技术有限公司;核酸水平电泳槽(Mini-Sub Cell GT Cell1704406,伯乐,美国)、微量离心机(Thermo Scientific Heraeus Pico 17/21 Fresco 17/21,Thermo Scientific,美国)、T100TMPCR仪购自上海凌仪生物科技有限公司;带数字相机(Leica DFC450)的光学显微镜(Leica DM2500)及其软件LAS v. 4.5.0 software package (Leica)购自广州市德灵实验仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1病原菌的分离与形态特征观察

本文采用常规的组织分离法[8]对病原菌进行分离鉴定:首先选取感病叶片,用剪刀在病健交界处剪取0.2 cm×0.2 cm左右的小块,并依次于70%乙醇中30 s,2%NaClO 2～3 min进行表面消毒,最后用无菌水冲洗3～5次,置于无菌滤纸上在超净台中晾干,置于PDA平板上在25℃培养箱中进行暗培养3 d。本次共分离获得8株真菌菌株。分别挑取各平板上菌落的单孢子接种于新的PDA平板上继续培养10 d后,于显微镜下对分离所得菌株的菌丝和孢子形态及大小进行镜检,每个菌株至少观察15～20个视野。

1.2.2致病性测定

在PD液体培养基中对XH1菌株进行过夜振荡培养,用血球计数法制成浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液。选取3株健康‘新会柑’植株,采用滴接法对离体叶片进行刺伤接种,每株上选2片叶,每片叶1～4个接种点;同时采用相同的方式在另外3株健康‘新会柑’植株叶片上滴接无菌水作为对照;并放置在27°C培养箱中进行培养,相对湿度为75%,L∥D=12 h∥12 h。接种后,每天对‘新会柑’的发病症状进行观察和记录,直至出现与‘新会柑’叶斑病田间相似的症状为止。

1.2.3病原菌的分子生物学鉴定

以分离获得的代表菌株XH1的全基因组DNA为模板进行PCR扩增。将培养10 d纯化菌株的菌丝和孢子从PDA平板上刮下,迅速用液氮研磨。根据动植物全基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。选取ITS(ITS1:5′ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和LSU基因(LR5F:5′-ATCCTGAGGGAAACTTC-3′,LROR:5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′)的引物进行PCR扩增[9-10]。反应体系:94℃预变性3 min;94℃变性40 s,53℃退火30 s,72℃延伸30 s, 34个循环;72℃ 5 min。取7 μL PCR产物进行电泳检测,并对获得的阳性PCR产物进行测序;将获得的序列在NCBI中进行BLAST比对分析,同时利用MegAlign 7.1.0(44)软件建立‘新会柑’叶斑病病原菌菌株XH1的系统发育树,从而确定其分类地位;引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 ‘新会柑’叶斑病田间症状及其病原菌形态特征

通过2018年5月至6月的调查研究发现,‘新会柑’叶斑病易发生在高湿高温的环境中。该病发病初期,受侵染的植株叶片上出现棕红色小点且带有水渍症状,而后逐渐扩展为带有黄色晕圈的不规则棕红色至褐色病斑,且病斑集中发生在幼嫩叶片的叶尖和叶缘,叶中部也有零星发生,老叶上发生较少。在调查的3个果园中,发病最重的为占地8 hm2的果园,大约有1/3柑橘植株的叶片上出现不同程度的病斑(图1a);随着时间的推移,整个叶片干枯脱落。

对采集的10个病样进行常规的组织分离,共获得8株真菌菌株。经过培养发现,其中7株菌株的生长模式一致,我们依次命名为XH1～7。XH1～7的菌落在PDA平板上均为圆形,最初粉红色,而后逐渐变为黄色且菌丝浓密; 分生孢子单生、圆柱形、浅棕色、基部钝圆或稍尖、光滑或具微疣、具有1～3个横隔和许多纵隔且在中间横隔膜处缢缩; 分生孢子的长度为33.4～52.7 μm,宽为10.8～16.6 μm (n=30),初步鉴定XH1～7属于匍柄霉属Stemphyliumsp.(图1b～e),因此本研究选取其代表菌株XH1进行后续研究。另一株菌株的菌落呈现白色,圆形,在显微镜下能够观察到明显的镰刀状大孢子和卵圆形小孢子,确定XH8为镰刀菌属Fusariumsp. 真菌(由于在后续人工接种试验中, XH8不能在‘新会柑’叶片上引起病害,故在此不做多叙)。

2.2 菌株XH1的致病性测定

接种菌株XH1的孢子悬浮液3 d后,健康‘新会柑’植株的叶片上出现针尖状深褐色水渍状小点;15 d后接菌‘新会柑’植株叶片上的发病症状与田间发病症状相似。从接种发病的叶片上可再分离获得单一的与原接种菌株在培养性状和形态特征上相一致的病原菌。根据柯赫氏法则,菌株XH1为‘新会柑’叶斑病的致病菌(图1f)。

2.3 菌株XH1的分子生物学鉴定

以XH1的gDNA为模板,采用引物ITS1/ITS4和LR5F/LROR进行PCR扩增,分别得到539 bp和871 bp的片段。通过胶回收和测序后,将得到的序列在GenBank中进行BLAST比对,发现菌株XH1(ITS:MZ165336;LSU:MZ165337)与番茄匍柄霉Stemphyliumlycopersici(ITS:MH863236;LSU:MH874764)的同源性分别为100%和99.89%。基于XH1获得的ITS和LSU序列构建系统发育树发现,菌株XH1序列与番茄匍柄霉的遗传距离最近,结合形态学特征及分子鉴定结果确定引起‘新会柑’叶斑病的病原菌为番茄匍柄霉S.lycopersici(图2)。

图2 基于ITS和LSU序列,构建‘新会柑’叶斑病原菌XH1及相似菌株的系统发育树(最大似然法)Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on ITS and LSU sequences of XH1 and related strains by using maximum likelihood method

3 讨论

本研究确定了引起‘新会柑’叶斑病的病原菌为番茄匍柄霉S.lycopersici,这是在我国乃至全世界首次报道番茄匍柄霉在‘新会柑’上引起病害。已有报道表明,番茄匍柄霉可以在酸浆Physalisalkekengi和夏日菊Zinniaelegans上引起叶斑病等[11-12]。有关引起‘新会柑’叶斑病病原菌番茄匍柄霉的侵染机制和病害防治措施等方面仍需进一步的研究。